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应用非标记定量蛋白质组学技术筛选基质小泡矿化相关蛋白

作　者: 周晓英
导　师: 韩金祥
学　校: 济南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: Saos-2细胞抗坏血酸 β-磷酸甘油矿化 ExoQuickTM MVs LC-MS/MS 非标记蛋白定量蛋白质组学 western blot MAS3.0 STING 钙结合蛋白
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

在骨形成和发生过程中，成骨细胞和软骨细胞通过分泌具有矿化能力的基质小泡（MVs）促使细胞外基质发生钙化。MVs是一种亚显微结构的（30-400nm），细胞外的，膜包被的，并且富含钙离子和磷酸根离子的小囊泡。MVs起源于细胞内囊泡。细胞内的囊泡运载了来自线粒体的大量钙离子，并与其内的磷酸根离子作用生成无定形磷酸钙。这种运载了无定形磷酸钙的小泡被释放至细胞外沉积于胶原纤维中后，就成为“基质小泡”。细胞外基质中的MVs继续吸收细胞外钙离子和酶解产生磷酸根离子，将不成熟的无定形磷酸钙转变为成熟的羟基磷灰石晶体（HA）。当MVs内充满HA后，针状的HA晶体便会刺破MVs的膜，最后沉积于细胞外基质中启动矿化。MVs在生物矿化启动过程中发挥重要作用，主要包括：提供羟基磷灰石成核位点启动生物矿化，调控细胞内外的Pi/PPi比值，调控细胞内外Ca2+和Pi的稳态，与细胞外基质蛋白相互作用调控羟基磷灰石晶体的分布和生长等。MVs的多种功能与其富含的矿化相关蛋白密不可分。近来，多种矿化能力细胞分泌的MVs的蛋白质组学已有报道，但是还没有研究对不同矿化阶段的MVs的蛋白质组学变化进行比较。Saos-2细胞属于人成骨肉瘤细胞，具有和成骨细胞一样的增殖、分化和矿化能力，并且矿化诱导液能加速其分泌并释放具有矿化能力的MVs。因此Saos-2细胞是体外研究MVs功能的良好细胞模型。MVs和exosomes的传统提取方法为超速离心法。近来研究者提出ExoQuick^TM试剂可用于有效提取exosomes。因此，我们尝试用ExoQuick^TM试剂提取矿化和未矿化的Saos-2细胞分泌的MVs。提取后的物质经形态学检查、标志抗原检测、碱性磷酸酶（ALP）活性分析以及体外形成羟基磷灰石的能力检测，确定为基质小泡。我们对两组矿化程度不同的MVs蛋白质组学用非标记定量技术进行比较分析，发现与钙离子相关的蛋白在矿化的MVs中高表达，包括19个钙结合蛋白（calcium binding proteins）、4个钙调素结合蛋白（calmodulin binding proteins, CaMBPs）和9个蛋白参与钙离子信号通路（calcium signaling pathway, CaSP）等。第一章Saos-2细胞矿化诱导模型的建立目的：采用抗坏血酸和β-磷酸甘油的矿化诱导液来促进Saos-2细胞成骨分化及矿化，建立细胞矿化模型。方法：将细胞分正常对照组、矿化诱导组进行培养：正常对照组在基础培养液中培养；矿化诱导组在基础培养液中添加50ug/ml抗坏血酸和7.5mM β-磷酸甘油的诱导培养液中培养。两组细胞培养第六天进行矿化结节定性和定量检测。结果：正常对照组Saos-2细胞在基础培养基条件下能发生微弱的矿化，显微镜视野中只能找到个别矿化结节；而经诱导处理的Saos-2细胞产生大量的羟基磷灰石。矿化结节定量结果显示诱导组产生的矿化结节是正常对照组的6倍左右。讨论：本实验中经矿化诱导的Saos-2细胞较正常培养的Saos-2细胞表现出强的钙化能力，产生大量羟基磷灰石。说明我们成功构建细胞矿化模型，为后续实验开展奠定了基础。第二章基质小泡提取和验证目的：检验ExoQuick^TM试剂方法能否有效提取基质小泡。方法：用ExoQuick^TM试剂方法提取正常培养和诱导培养Saos-2细胞的细胞外分泌物。分泌物提取后用电子显微镜检测其形态，用p-NPP检测其ALP活性检测，同时用western blot的方法检测其表面标志物CD63、CD9和Hsp70表达情况。另外，将提取后的物质在矿化缓冲溶液中孵育12h，用傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）检测矿物沉淀的组成，用钙离子检测试剂盒检测提取物在孵育前后的钙离子的浓度变化。结果：采用ExoQuickTM试剂提取正常和诱导Saos-2细胞分泌的物质经离心后团块呈乳白色，团块切片后经电子显微观察发现来自两组细胞的提取物直径均在30-400nm之间，为膜包被小泡，诱导组的小泡内有明显的高电子密度物质且ALP活性明显高于正常组，两组小泡均表达CD63、CD9和Hsp70。经矿化缓冲液中孵育12小时后，矿化组提取的小泡中的钙离子浓度较孵育前显著上升且有统计学意义，且孵育后小泡-矿物沉淀的红外光谱图与HA标准品相似。讨论：根据形态学观察、表面标志物的检测和ALP活性情况，数据显示ExoQuickTM试剂提取的物质为MVs。Saos-2细胞经矿化诱导液刺激后，细胞外基质矿化程度比未诱导刺激的细胞显著增加，而且分泌的基质小泡也具有高的ALP活性和羟基磷灰石晶体沉积。ALP作为MVs和矿化标志蛋白，说明来自诱导组和正常组的基质小泡在矿化程度上差异明显，可以作为矿化不同时期的研究模型。提取后的基质小泡在矿化缓冲液中仍能继续吸收钙离子生成羟基磷灰石，说明我们提取操作没有破坏MVs的完整性。MVs拥有自身的一套特殊蛋白质组可以独立于细胞生成羟基磷灰石的能力。因此，通过研究矿化不同阶段的MVs蛋白质组变化寻找与矿化相关的蛋白可以丰富我们对生物矿化的理解。第三章MVs非标记定量蛋白质组学分析目的：采用非标记定量技术比较正常组和诱导组基质小泡的蛋白质组学差异变化。方法：采用最新一代的orbitrap质谱（Q-exacitve）采集LC-MS/MS数据，然后用Maxquant中的Label free算法是对蛋白质组学数据进行非标记定量计算。结果：本次实验共鉴定肽段数11569个，蛋白质数1961个，其中2次实验中共同鉴定出的蛋白质数为756个。利用Maxquant软件并结合Uniprot人蛋白数据库，发现并鉴定了明显差异蛋白255种（比值大于2），其中186种蛋白上调，69种蛋白下调。结论：本研究首次应用蛋白质组学非标记定量技术对矿化和矿化的基质小泡进行差异蛋白质学研究。第四章MVs蛋白表达谱的生物信息学分析及验证目的：对非标记定量蛋白质组结果进行生物信息学分析。方法：通过MAS3.0和STRING9.05软件分别对差异表达蛋白进行GO分析，信号通路分析和蛋白相互作用分析。选取4个钙结合蛋白（GRP94, Calnexin,Calregulin, S100A10）以及ALP进行Western Blot实验验证。结果：表达差异的蛋白经生物信息学分析发现，矿化的基质小泡中与钙离子相关的蛋白高表达，其中包括钙离子结合蛋白、钙调素结合蛋白和钙离子信号通路蛋白。Western结果与非标记定量质谱结果一致，ALP和四个钙离子结合蛋白（Grp94、Calnexin、Calregulin和S100A10）均在矿化的MVs中高表达。结论：来自正常和诱导组Saos-2细胞的基质小泡的蛋白质组成不同，这些表达差异的蛋白与矿化过程密不可分。钙离子结合蛋白、钙调素结合蛋白和钙离子信号通路蛋白等钙离子相关蛋白可能在基质小泡的生物合成，矿物成核，以及钙离子转运、钙离子稳态和钙离子信号通路中发挥重要作用。5个蛋白的Westernblot验证结果与非标记定量质谱结果一致，说明LC-MS/MS质谱鉴定数据和非标记定量分析的可靠性。

全文目录

导师简介及课题组成员  5-8
摘要  8-12
ABSTRACT  12-17
主要符号表  17-18
前言  18-26
  1 基质小泡  18-23
    1.1 概述  18-19
    1.2 基质小泡介导的矿化机制  19-21
    1.3 基质小泡蛋白与 Pi/PPi 比值  21-23
  2 非标记定量蛋白质组学技术  23-26
第一章 SAOS-2 细胞矿化诱导模型的建立  26-30
  1 材料与方法  26-28
    1.1 材料  26-27
    1.2 方法  27-28
  2 结果  28-29
  3 讨论  29-30
第二章基质小泡提取和验证  30-39
  1 材料与方法  30-36
    1.1 材料  30-32
    1.2 方法  32-36
  2 结果  36-38
  3 讨论  38-39
第三章 MVS 非标记定量蛋白质组学分析  39-45
  1 材料与方法  39-42
    1.1 材料  39-40
    1.2 方法  40-42
  2 结果  42-44
  3 结论  44-45
第四章 MVS 蛋白表达谱的生物信息学分析及验证  45-54
  1 材料与方法  45-49
    1.1 材料  45-46
    1.2 方法  46-49
  2 结果  49-52
    2.1 差异表达蛋白谱  49
    2.2 基因注释分析结果  49-52
  3 讨论  52-54
参考文献  54-61
附录  61-80
综述  80-108
  References  102-108
在校期间发表论文  108-109
致谢  109

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