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CMY-39型AmpC酶的原核表达和特性研究

作　者: 谭皓妍
导　师: 黄俊
学　校: 广州医学院
专　业: 免疫学
关键词: AmpC酶 CMY-39 原核表达酶动力学
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：对从临床分离的弗劳地枸橼酸杆菌（标本号90757）产生的CMY-39型AmpC酶蛋白进行药物敏感试验和酶特性研究。方法：（1）对弗劳地枸橼酸杆菌作头孢西丁敏感试验及三维试验以检测AmpC酶，提取菌株质粒进行CIT序列扩增并确定其基因分型。（2）参照Genbank上的CMY-39型AmpC酶基因序列设计合成CMY-39基因的PCR引物，以90757号菌的总基因组作为模板，PCR扩增CMY-39的编码基因，将CMY-39的PCR产物纯化后与pGEM-T载体连接，测定CMY-39的核苷酸序列。（3）将CMY-39基因克隆到PET-32a(+)系统进行重组，重组质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达，SDS-PAGE电泳鉴定酶蛋白的表达。（4）取CMY-39重组菌和原菌株进行药物敏感试验，提取重组菌的CMY-39蛋白进行三维试验和Western blot检测，并对此酶蛋白进行酶动力学检测。结果：（1）证实90757号菌株为产CMY-39型AmpC酶的弗劳地枸橼酸杆菌，序列分析结果显示目的基因片段长1146bp，经GenBank同源性比较，目的基因的氨基酸序列与GenBank上登录的CMY-39编码基因同源性为99％，它是CMY-39的突变株，为新型的CMY基因型，GenBank登陆号为HM565135。（2）成功构建PET32a(+)/CMY-39重组质粒，经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，得到大小为1146bp和5901bp左右的片断。（3）SDS-PAGE电泳结果显示，重组菌株经18℃诱导过夜后可见明显特异性表达条带，分子量约60KD。（4）药物敏感试验显示，CMY-39重组菌株保持了产CMY型酶菌株的耐药特征，对第一、二代头孢菌素和头霉素类表现为耐药，对第三、四代头孢菌素，氨基糖苷类和碳青霉烯类表现为敏感，耐药性不被β-内酰胺酶抑制剂，如他唑巴坦抑制。（5）酶动力学数据显示，重组酶测定的Km值与原菌株相比，均有不同程度的升高，表明重组酶与底物的亲和力下降。结论：（1）重组菌所产的AmpC酶基因型为CMY-39新基因亚型，登陆号为HM565135。（2）在PET32a/BL21系统中成功表达重组的CMY-39型酶。（3）重组菌与原菌株比较，对β-内酰胺类抗生素的敏感性和稳定性增加，亲和力下降。

全文目录

英文缩略词  3-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-13
第一部分 CMY-39 型 AmpCβ-内酰胺酶的基因鉴定和克隆  13-29
  一、材料和方法  13-20
  二、结果  20-27
  三、讨论  27-28
  结论  28-29
第二部分 CMY-39 型 AmpCβ-内酰胺酶的原核表达  29-39
  一、材料和方法  29-34
  二、结果  34-37
  三、讨论  37-38
  结论  38-39
第三部分 CMY-39 型 AmpCβ-内酰胺酶的特性研究  39-46
  一、材料与方法  39-41
  二、结果  41-43
  三、讨论  43-45
  结论  45-46
参考文献  46-50
综述  50-58
  参考文献  55-58
研究生期间论文发表情况  58-59
致谢  59-61

CMY-39型AmpC酶的原核表达和特性研究

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