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毕赤酵母STE13基因敲除对GGH表达及其生物活性的影响

作　者: 路庆鹏
导　师: 许正宏
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 毕赤酵母 GLP-1 STE13 Cre-Loxp重组系统生物活性
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

胰高糖素样多肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）是由肠道L细胞合成和分泌的30肽，其不仅可通过刺激胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素的释放达到调节血糖的功效，且具有保护胰岛β细胞的生长及抑制其凋亡的功能。本实验室前期基于融合PCR技术构建了GLP-1突变串联体与人血清白蛋白的表达质粒((GLP-1A2G)2-HSA，简称GGH)并实现了在毕赤酵母GS115中的表达。细胞活性测评结果表明，GGH的生物活性还较低，且蛋白N端也存在不同程度的降解，蛋白质结构的缺失可能是产物GGH生物活性较低的直接原因；本文针对这一问题，通过敲除STE13基因构建STE13基因缺陷型菌株GS115/D13，并对重组菌表达产物进行N端测序分析；同时对重组蛋白进行分离纯化并与原始GGH进行生物活性对比。得到以下主要结论：(1)基于PCR技术介导的Cre-loxp系统重组技术，构建STE13基因敲除组件UCD，并电转入毕赤酵母体内进行同源重组，通过同源臂双交换替换目的基因，Zeocin抗性筛选阳性克隆，再次通过甲醇诱导Cre重组酶表达，并进行体内二次重组，去除抗性标签，构建了STE13基因缺陷型菌株GS115/D13。(2) STE13基因缺陷型菌株GS115/D13与出发菌株GS115/W发酵实验结果表明，GS115/D13菌株融合蛋白GGH表达量提高了25.8%，两菌株生长状态无明显差异，考察了诱导条件对重组菌GS115/D13表达融合蛋白的影响，在对表达产物GGH的N端测序结果中发现蛋白N端降解得到一定改善。(3)确定了融合蛋白GGH的分离纯化路线：发酵上清液经过微滤及超滤浓缩，再分别经过四步层析柱的分离纯化，纯化过程总回收率为31.9%，最后利用SDS-PAGE及Bardford蛋白定量检测蛋白浓度。(4)纯化产物生物活性实验结果显示，在相同的给药浓度梯度情况下，STE13基因缺陷型菌株GS115/D13中表达产物GGH刺激细胞株产生的cAMP值远高于出发菌株的GGH，表明STE13基因缺陷型GS115/D13菌株GGH生物活性较出发菌株生物活性有明显的提高。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-5
目录  5-8
第一章绪论  8-14
  1.1 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的概况  8-9
    1.1.1 GLP-1 的结构  8
    1.1.2 GLP-1 的生理功能  8
    1.1.3 GLP-1 长效性研究  8-9
  1.2 毕赤酵母表达系统  9-11
    1.2.1 毕赤酵母简介  9
    1.2.2 毕赤酵母宿主菌及表达载体  9-10
    1.2.3 提高外源蛋白在毕赤酵母系统中的表达量的研究  10-11
    1.2.4 解决外源蛋白表达过程中的降解问题的研究  11
  1.3 CRE/LOXP 系统重组  11-12
    1.3.1 Cre/loxp 系统重组原理  11-12
    1.3.2 Cre/loxp 敲除系统在毕赤酵母中的应用  12
  1.4 立题意义和研究内容  12-14
    1.4.1 立题意义  12-13
    1.4.2 研究内容  13-14
第二章 STE13 基因缺陷型菌株的构建  14-27
  2.1 材料  14-15
    2.1.1 主要仪器  14-15
    2.1.2 主要试剂  15
    2.1.3 菌株及质粒  15
    2.1.4 培养基  15
  2.2 实验方法  15-24
    2.2.1 STE13 基因的扩增及测序验证  15-16
    2.2.2 同源臂片段的扩增与回收  16-17
    2.2.3 融合上下同源臂片段并连入 T 载体  17-19
    2.2.4 阳性转化子的验证  19-20
    2.2.5 Cre-ZeoR 片段的扩增  20
    2.2.6 Cre-ZeoR 片段连入 UD/T 质粒  20-21
    2.2.7 UCD 质粒的 PCR 验证  21-22
    2.2.8 线性化质粒 UCD/pMD 19-T  22
    2.2.9 毕赤酵母 GS115/W 感受态制备及电转化  22-23
    2.2.10 毕赤酵母阳性重组子的筛选及 PCR 验证  23-24
  2.3 结果与讨论  24-26
    2.3.1 融合蛋白 GGH 的 N 端序列分析  24-25
    2.3.2 STE13 基因的 PCR 扩增及测序验证  25
    2.3.3 UCD 融合片段构建流程  25
    2.3.4 UCD/pMD 19-T 质粒的 PCR 及酶切验证  25-26
  2.4 本章小结  26-27
第三章 STE13 基因缺陷菌株与出发菌株的比较  27-36
  3.1 材料  27-28
    3.1.1 主要仪器  27
    3.1.2 主要试剂  27-28
    3.1.3 菌株及质粒  28
    3.1.4 培养基  28
  3.2 实验方法  28-30
    3.2.1 毕赤酵母基因组提取  28
    3.2.2 诱导去除抗性标签并进行二次 PCR 验证  28-29
    3.2.3 STE13 缺陷菌株 GS115/D13 与出发菌株 GS115/W 摇床诱导对比  29
    3.2.4 诱导条件对重组菌 GS115/D13 表达量的影响  29-30
      3.2.4.1 诱导时间对 GS115/D13 表达量的影响  29-30
      3.2.4.2 甲醇浓度诱导对 GS115/D13 表达量的影响  30
      3.2.4.3 诱导温度对 GS115/D13 表达量的影响  30
    3.2.5 融合蛋白 GGH 转 PVDF 膜及 N 端测序  30
  3.3 结果与讨论  30-35
    3.3.1 毕赤酵母基因组的提取  30-31
    3.3.2 PCR 验证 STE13 基因的敲除  31-32
    3.3.3 STE13 缺陷菌株与出发菌株的生长曲线与蛋白表达量的比较  32
    3.3.4 诱导时间对重组菌 GS115/D13 表达的影响  32-33
    3.3.5 甲醇浓度诱导对重组菌 GS115/D13 表达的影响  33-34
    3.3.6 温度对重组菌 GS115/D13 表达的影响  34
    3.3.7 融合蛋白 GGH 转膜及 N 端测序  34-35
  3.4 本章小结  35-36
第四章重组菌 GS115/D13 中 GGH 的分离纯化及活性评价  36-44
  4.1 材料  36-37
    4.1.1 主要仪器  36-37
    4.1.2 主要试剂  37
    4.1.3 菌株  37
  4.2 实验方法  37-39
    4.2.1 融合蛋白 GGH 超滤浓缩  37
    4.2.2 Blue Sepharose Fast Flow 层析  37
    4.2.3 Phenyl Sepharose Fast Flow 层析  37-38
    4.2.4 Q Sepharose Fast Flow 层析  38
    4.2.5 凝胶 Sephadex G25 层析：  38
    4.2.6 融合蛋白 GGH 浓度检测  38
    4.2.7 融合蛋白 GGH 活性评价  38-39
  4.3 结果与讨论  39-42
    4.3.1 融合蛋白 GGH 超滤浓缩  39
    4.3.2 AKTA 分离纯化结果  39-41
    4.3.3 融合蛋白 GGH 的纯化工艺  41
    4.3.4 融合蛋白 GGH 浓度鉴定  41-42
    4.3.5 融合蛋白 GGH 的活性评价  42
  4.4 本章小结  42-44
第五章结论与展望  44-45
  5.1 主要结论  44
  5.2 存在的问题  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-50
附录 1：核苷酸序列  50-52
附录 2：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  52

毕赤酵母STE13基因敲除对GGH表达及其生物活性的影响

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