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RNA适体与代谢小分子相互作用的研究

作　者: 朱颖
导　师: 于文功
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: RNA适体指数富集配体系统进化技术 sRNA 代谢小分子
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

核酸适体（Nucleic acid aptamer）是一类经指数富集配体系统进化技术SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）从体外人工合成的单链核酸文库中筛选出的核酸小分子，分为DNA适体和RNA适体。其中RNA适体因其二级结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点，而且易改造修饰、制备方便，在基础研究、临床诊断、药物研制等方面展现了广阔的应用前景。本论文以精氨酸为研究对象通过SELEX筛选技术获得了特异性结合精氨酸的RNA适体，并对其生物活性进行了评价。本实验中，我们通过体外合成的方式构建了单链DNA文库，总长度100个核苷酸，由两端37个固定接头序列和中间63个随机序列构成；利用PCR技术对DNA文库进行双链扩增，再通过体外转录的方式获得筛选的起始材料——单链RNA文库。RNA文库中含有63个随机排布的核苷酸，4种碱基分布均匀，几乎囊括了所有随机组合的可能性。我们选择代谢小分子精氨酸作为研究对象，利用共价耦联琼脂糖珠子的精氨酸作为固定相，对单链RNA文库进行体外筛选；对筛选获得的RNA序列进行反转录、体外扩增和转录，形成次一级核酸文库，利用生成的次一级核酸文库重复筛选过程；直到获得与靶分子精氨酸亲和力较高的RNA适体。在筛选过程中，通过调节PCR循环数提高了生成目标产物的效率；通过在T7启动子前添加一段调节序列，解决了随机文库转录效率低的困难。经过了22轮的体外筛选，我们获得了在测序过程中出现频率最高的一段RNA序列（命名为22-7），该序列在100个测序的克隆中重复出现了6次，在第20轮测序中的100个克隆中重复出现了5次。体外转录合成了该序列并利用ITC分析，发现该序利与游离的精氨酸有较高的亲和力。为了研究该适体是否能够在原核生物体内发挥功能，我们首先利用BLAST分析了22-7与大肠杆菌RNA的序列同源性，结果表明同源性不存在，然后我们将RNA适体22-7通过添加内源小RNA的转录元件，构建了其在大肠杆菌中的过表达体系。选取大肠杆菌精氨酸分解代谢AST途径中的两个基因——精氨酸琥珀酰转移酶（astA）和琥珀酰鸟氨酸转氨酶（astC）为研究对象，对RNA适体体内生物活性进行评价。实验证明，RNA适体22-7过表达之后，astA和astC表达水平明显受到抑制。由此说明，RNA适体22-7在大肠杆菌体内诱导表达后，对精氨酸代谢相关基因起到了调控的作用。细菌小RNA（sRNA）是一类长度在50~500nt的调控RNA，它能通过与靶标mRNA以不完全配对方式结合来发挥调控作用，那么sRNA是否具有适体结合代谢小分子的功能呢？通过比较我们选取了与糖代谢相关的SgrS进行验证，SgrS是葡萄糖压力相关的sRNA，当葡萄糖压力增大时，SgrS能阻止葡萄糖分子的跨膜运输。我们首先构建了SgrS过表达体系，检测在有或无葡萄糖刺激的情况下，其靶基因ptsG的表达水平是否发生变化。实验结果证明，SgrS对其靶基因ptsG表达水平的影响不依赖于葡萄糖。综上所述，我们利用SELEX筛选技术获得了能够和精氨酸特异性结合的RNA适体，构建了其在大肠杆菌体内的过表达体系，初步评价了其在大肠肝菌内的生物功能，并且验证了细菌sRNA——SgrS是否具有结合代谢小分子的功能。本论文通过探索RNA适体与代谢小分子的相互作用，为原核生物非编码小RNA调控基因表达提供了新思路。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
0 前言  13-29
  0.1 RNA 适体  13-20
    0.1.1 RNA 适体的产生及特点  13-15
    0.1.2 RNA 适体与配体的相互作用  15-16
    0.1.3 RNA 适体与抗体的比较  16-17
    0.1.4 RNA 适体在医药学领域的研究现状  17-19
    0.1.5 RNA 适体的局限性及解决策略  19-20
  0.2 原核生物中的非编码小 RNA  20-26
    0.2.1 原核分编码小 RNA 根据功能的分类  21-25
    0.2.2 分子伴侣 Hfq 的作用  25
    0.2.3 sRNA 功能的研究方法  25-26
    0.2.4 sRNA 的研究前景  26
  0.3 大肠杆菌中精氨酸的代谢途径  26-29
1 体外筛选特异性结合精氨酸的 RNA 适体  29-52
  1.1 实验材料  29-32
    1.1.1 体外合成核酸文库  29
    1.1.2 菌株和质粒  29-30
    1.1.3 主要试剂  30-31
    1.1.4 培养基和溶液  31-32
  1.2 实验仪器  32-33
  1.3 实验方法  33-40
    1.3.1 体外构建单链 DNA 核酸文库  33
    1.3.2 DNA 核酸文库的体外扩增及条件优化  33-35
    1.3.3 RNA 文库的体外构建  35-36
    1.3.4 核酸纯化方案  36-37
    1.3.5 RNA 文库筛选结合精氨酸序列实验方案  37-38
    1.3.6 次一级核酸文库的获得  38
    1.3.7 连接转化测序鉴定实验方案  38-40
    1.3.8 ITC 检测相互作用  40
  1.4 实验结果  40-51
    1.4.1 双链 DNA 文库的获得  40-41
    1.4.2 单链 RNA 文库的获得  41-42
    1.4.3 次级文库的扩增  42-44
    1.4.4 筛选过程中阳性克隆的鉴定  44-45
    1.4.5 筛选结果鉴定分析  45-46
    1.4.6 RNA 序列结果分析  46-49
    1.4.7 独立结合实验证明上述两个 RNA 分子的结合能力  49-50
    1.4.8 ITC 检测 22-7 与游离精氨酸的结合力  50-51
  1.5 小结与讨论  51-52
2 RNA 适体 22-7 过表达体系的构建及其生物活性评价  52-71
  2.1 实验材料  52-54
    2.1.1 菌株和质粒  52-53
    2.1.2 主要试剂  53
    2.1.3 培养基和溶液  53-54
  2.2 实验仪器  54
  2.3 实验方法  54-61
    2.3.1 体外合成 22-7 序列  54-55
    2.3.2 碱裂解法提取质粒  55-56
    2.3.3 双酶切目的片段  56
    2.3.4 胶回收目的片段  56-57
    2.3.5 定点突变 pBAD/gIII B 载体实验方案  57-58
    2.3.6 定点突变产物阳性克隆鉴定  58
    2.3.7 双切 pBAD 载体序列  58
    2.3.8 目的片段与载体连接  58-59
    2.3.9 细菌总 RNA 提取  59
    2.3.10 反转录 PCR  59-60
    2.3.11 实时荧光定量 PCR  60-61
  2.4 实验结果  61-69
    2.4.1 22-7 序列 BLAST 序列分析  61
    2.4.2 PUC 57 质粒提取  61-62
    2.4.3 PUC 57 质粒双酶切电泳结果  62
    2.4.4 pBAD 质粒定点突变电泳结果  62-63
    2.4.5 pBAD 双切胶回收电泳结果  63
    2.4.6 pBAD 连接目的片段阳性克隆的鉴定  63-64
    2.4.7 诱导表达 22-7 对细菌生长的影响  64
    2.4.8 细菌总 RNA 提取电泳结果  64-65
    2.4.9 过表达体系检测 22-7 表达水平  65-66
    2.4.10 荧光定量检测基因表达水平  66-69
  2.5 小结与讨论  69-71
3 非编码小 RNA 结合代谢小分子功能的探索  71-82
  3.1 实验材料  71-72
    3.1.1 菌株和质粒  71
    3.1.2 主要试剂  71-72
  3.2 实验器材  72
  3.3 实验方法  72-75
    3.3.1 pBAD 定点突变后双酶切  72
    3.3.2 大肠杆菌基因组提取  72-73
    3.3.3 sgrS 基因克隆  73-74
    3.3.4 目的基因片段与 T 载体连接，测序鉴定  74
    3.3.5 sgrS 连接 T 载体双酶切鉴定回收  74
    3.3.6 目的片段 sgrS 连接载体 pBAD  74-75
  3.4 实验结果  75-81
    3.4.1 基因组提取  75
    3.4.2 sgrS 基因克隆  75
    3.4.3 pBAD 定点突变琼脂糖电泳图  75-76
    3.4.4 双酶切转化鉴定  76
    3.4.5 sgrS 连 T 载体双切回收目的片段  76-77
    3.4.6 sgrS 连 pBAD 载体，双酶切鉴定阳性克隆  77
    3.4.7 SgrS 过表达对细菌生长的影响  77-78
    3.4.8 细菌总 RNA 提取  78
    3.4.9 实时荧光定量 PCR 检测 SgrS 过表达量  78-79
    3.4.10 荧光定量 PCR 检测靶基因 ptsG 表达水平  79-81
  3.5 小结与讨论  81-82
总结与展望  82-83
参考文献  83-90
致谢  90-91
个人简历  91
在学期间发表的学术论文  91-92

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