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地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓、抗肿瘤及其基因克隆与表达的研究

作　者: 李兴暖
导　师: 韩雅莉
学　校: 汕头大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓抗肿瘤肿瘤血管生成基因克隆表达
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

地鳖虫(Eupolyphaga sinensis walker)，为《中华人民共和国药典》(2000版)记载的正品药材，是传统的活血化瘀类动物药，其功效主要为逐瘀、破积、通络、理伤。现代药理试验已充分证明地鳖虫具有溶解静脉血栓、抑制血小板聚集和抗凝血等药用功效。但是传统中医用药均以全虫入药，对其药效成分不明确，且对其作用机理研究不充分，本文从地鳖虫体内提取出纤溶活性蛋白(Eupolyphaga sinesis Walker Hbrinolytic Protein，EFP)成分进行实验，首先研究它在抗血栓形成、抗凝血和增强纤溶方面的作用。抗肿瘤血管生成的研究是当前抗肿瘤研究的热门课题，随着中药抗肿瘤研究的不断深入，发现某些中药，特别是一些具有活血化瘀作用的中药均具有抗肿瘤功效，其抗肿瘤的机制在于抑制肿瘤血管的生成。基于此，本文还研究了地鳖虫纤溶活性蛋白在抑制抑制血管生成和抗肿瘤方面的作用。为深入研究地鳖虫纤溶活性蛋白，本文还克隆了地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA序列，并用大肠杆菌和毕赤酵母表达系统进行了表达。本文主要研究结果如下：(1)用地鳖虫纤溶活性蛋白(ig.)作用于角叉菜胶所致血栓的小鼠模型和正常小鼠，结果表明地鳖虫纤溶活性蛋白能够抑制角叉菜胶所致的小鼠尾部血栓的形成，能明显延长正常小鼠凝血酶时间，增强其组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的活性、抑制其组织型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)的活性。显示了地鳖虫纤溶活性蛋白具有良好的体内抗血栓作用。(2)以MTT法检测地鳖虫纤溶活性蛋白对体外培养的人微血管内皮细胞(MVEC)增殖的影响，结果表明EFP能有效抑制MVEC的增殖，实验浓度(0.02-200μg/ml)范围内最高抑制率达45.93％，且呈剂量依赖关系。(3)利用Annexin V-FITC/PI双荧光染色法和单细胞凝胶电泳(SCGE)法检测了EFP对MVEC凋亡的影响，结果表明EFP能显著促进MVEC细胞的凋亡。(4)通过流式细胞术检测了EFP对MVEC细胞周期的影响，结果EFP可将MVEC细胞阻滞在S期和_G2/M期，使细胞不能进行分裂，抑制其增殖。(5)用鸡胚尿囊膜(CAM)模型检测EFP对血管形成的抑制作用，结果发现EFP能显著抑制鸡胚尿囊膜的血管生成，且具有一定的量应关系。(6)体内抑瘤实验结果表明，EFP能显著抑制S180和H22荷瘤小鼠实体瘤的生长，最高抑制率分别达48.54％和42.16％。(7)检测H22荷瘤小鼠肝脏丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，结果表明，EFP还能够增强小鼠体内抗氧化能力；检测H22荷瘤小鼠血清抗H22抗体水平和测量小鼠脾脏系数，结果表明EFP还能增强小鼠机体的体液免疫能力。(8)分析多种动物纤溶酶氨基酸序列，根据其同源性，获得保守序列，利用保守序列设计简并引物，进行PCR扩增。由于多种动物纤溶酶成熟肽N端具有一段非常保守的序列，在设计兼并引物时选取了该段保守序列，所以PCR扩增得到是具有完整5’末端的cDNA序列。然后利用3’末端快速扩增法(RACE)获得了该序列的3’末端，经拼接得到了完整的EFP基因cDNA序列。(9)利用大肠杆菌表达系统对EFP基因进行表达，首先构建了原核表达载体pET28a-EFP，转化表达菌株Rossetta，用IPTG进行诱导表达，结果经SDS-PAGE和Western blot鉴定，表明目的蛋白获得了表达，最高表达量约占细菌总蛋白的10％。但目的蛋白以包涵体的形式表达，无生物学活性。(10)将EFP cDNA基因与分泌型酵母表达载体pPICZαA进行重组，转化毕赤酵母表达菌株GS115，得到的转化子经甲醇诱导后，诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blot分析证明目的蛋白获得了表达，经纤维蛋白平板法检测，发现目的蛋白具有纤溶活性。上述研究结果从不同方面表明地鳖虫纤溶活性蛋白具有抗血栓、抗肿瘤和抗肿瘤血管生成的作用；另外，成功克隆了EFP cDNA基因，并用毕赤酵母表达系统表达出了具有纤溶活性的蛋白。

全文目录

中文摘要  3-5
Abstract  5-7
缩略语  7-9
目录  9-14
第1章前言  14-30
  1.1 血栓与溶栓药物  14-19
    1.1.1 血栓的形成及危害  14
    1.1.2 溶栓药物的研究历史  14-16
    1.1.3 溶栓药物的主要来源  16-18
    1.1.4 地鳖虫溶栓作用的研究  18-19
  1.2 抗肿瘤及抗肿瘤血管生成的研究  19-22
    1.2.1 血管生成与肿瘤血管生成  19-20
    1.2.2 肿瘤血管生成的调控因子  20-21
    1.2.3 中药抗肿瘤血管生成的研究  21-22
  1.3 大肠杆菌表达系统  22-24
    1.3.1 宿主细胞  22-23
    1.3.2 表达载体  23-24
    1.3.3 影响外源蛋白表达的因素  24
  1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统  24-28
    1.4.1 巴斯德毕赤酵母的生物学特性  25
    1.4.2 毕赤酵母表达载体的类型  25-26
    1.4.3 质粒在毕赤酵母中的整合  26
    1.4.4 影响外源基因在毕赤酵母中表达的因素  26-28
  1.5 本文研究的主要内容及意义  28-30
第2章地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓的研究  30-35
  2.1 实验材料  30
    2.1.1 实验动物  30
    2.1.2 试剂  30
    2.1.3 主要仪器  30
  2.2 实验方法  30-32
    2.2.1 地鳖虫纤溶活性蛋白的制备及纤溶活性测定方法  30-31
    2.2.2 地鳖虫纤溶活性蛋白对小鼠KPTT、TT、PT、t-PA和PAI的影响  31
    2.2.3 地鳖虫纤溶活性蛋白对角叉菜胶致小鼠尾部血栓形成的影响  31
    2.2.4 数据处理  31-32
  2.3 结果  32-33
    2.3.1 地鳖虫纤溶活性蛋白对小鼠KPTT、TT和PT的影响  32-33
    2.3.2 地鳖虫纤溶活性蛋白对小鼠t-PA、PAI活性的影响  33
    2.3.3 地鳖虫纤溶活性蛋白对角叉菜胶所致小鼠尾部血栓形成的影响  33
  2.4 讨论  33-35
第3章地鳖虫纤溶活性蛋白抗血管生成及抗肿瘤的研究  35-50
  3.1 实验材料  35-36
    3.1.1 实验动物、细胞、瘤株  35
    3.1.2 主要试剂  35
    3.1.3 主要仪器  35-36
  3.2 实验方法  36-40
    3.2.1 地鳖虫纤溶活性蛋白的提取与纤溶活性测定  36
    3.2.2 细胞培养  36
    3.2.3 EFP对人微血管内皮细胞增殖的影响  36-37
    3.2.4 EFP对人微血管内皮细胞凋亡的作用  37
    3.2.5 流式细胞仪分析EFP对MVEC细胞周期的影响  37-38
    3.2.6 EFP对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的影响  38
    3.2.7 地鳖虫纤溶活性蛋白对S180和H22荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用  38-40
    3.2.8 数据处理  40
  3.3 结果  40-45
    3.3.1 EFP对人微血管内皮细胞增殖的影响  40-41
    3.3.2 EFP对人微血管内皮细胞凋亡的作用  41
    3.3.3 流式细胞仪分析EFP对人微血管内皮细胞周期的影响  41-42
    3.3.4 EFP对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的影响  42-43
    3.3.5 地鳖虫纤溶活性蛋白对S180和H22荷瘤小鼠的体内抗肿瘤作用  43-45
  3.4 讨论  45-50
    3.4.1 抗肿瘤血管生成的研究  45-48
    3.4.2 抗肿瘤的研究  48-50
第4章地鳖虫纤溶活性蛋白基因的cDNA克隆  50-58
  4.1 实验材料  50-51
    4.1.1 菌种和载体  50
    4.1.2 主要试剂  50
    4.1.3 主要仪器  50
    4.1.4 引物  50-51
  4.2 实验方法  51-53
    4.2.1 地鳖虫总RNA的提取  51
    4.2.2 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA5’端序列的合成  51-52
    4.2.3 3’RACE 法合成地鳖虫纤溶活性蛋白基因 cDNA 序列的3’端  52-53
    4.2.4 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA的克隆  53
  4.3 结果  53-57
    4.3.1 总RNA的提取  53-54
    4.3.2 PCR扩增合成地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA5’端序列  54
    4.3.3 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA3’末端的合成  54-55
    4.3.4 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA序列的获得及PCR扩增与序列测序  55-56
    4.3.5 地鳖虫纤溶活性蛋白基因cDNA的序列分析及氨基酸序列同源性分析  56-57
  4.4 讨论  57-58
第5章地鳖虫纤溶活性蛋白的大肠杆菌表达  58-71
  5.1 实验材料  58-59
    5.1.1 菌株和质粒  58
    5.1.2 主要试剂  58
    5.1.3 培养基和溶液  58-59
    5.1.4 主要仪器和设备  59
  5.2 实验方法  59-64
    5.2.1 引物的设计与合成  59
    5.2.2 PCR扩增  59-60
    5.2.3 PCR产物的胶回收与纯化  60
    5.2.4 目的基因克隆至pUCm-T载体  60
    5.2.5 酶切鉴定  60-61
    5.2.6 DNA序列测序  61
    5.2.7 表达载体pET28a和pUCm-T-EFP的制备和酶切  61
    5.2.8 连接反应  61-62
    5.2.9 转化大肠杆菌DH5a  62
    5.2.10 重组转化子的鉴定  62
    5.2.11 重组质粒的测序  62
    5.2.12 重组质粒转化表达菌株E.coli Rossetta(DE3)plysS  62
    5.2.13 工程菌的诱导表达  62
    5.2.14 表达蛋白的可溶性分析  62-63
    5.2.15 Western-blot分析  63
    5.2.16 工程菌的优化表达  63
    5.2.17 重组表达蛋白抗血清的制备  63-64
  5.3 实验结果  64-69
    5.3.1 地鳖虫纤溶活性蛋白基因的PCR扩增及pUCm-T-EFP载体的构建和酶切鉴定  64-65
    5.3.2 pET28a-EFP的构建、酶切鉴定和测序  65-66
    5.3.3 工程菌的诱导表达  66
    5.3.4 表达蛋白的可溶性分析  66-68
    5.3.5 表达蛋白的Western-blot分析结果  68-69
    5.3.6 工程菌的优化表达  69
    5.3.7 重组表达蛋白抗血清的制备  69
  5.4 讨论  69-71
第6章地鳖虫纤溶活性蛋白的毕赤酵母表达  71-86
  6.1 实验材料  71-74
    6.1.1 菌株和质粒  71
    6.1.2 主要试剂  71
    6.1.3 培养基和溶液  71-74
    6.1.4 主要仪器和设备  74
  6.2 实验方法  74-79
    6.2.1 引物的设计与合成  74
    6.2.2 PCR扩增  74-75
    6.2.3 PCR产物的胶回收及纯化  75
    6.2.4 回收产物的双酶切和纯化  75-76
    6.2.5 质粒载体pPICZa-A的制备和酶切  76
    6.2.6 连接反应  76
    6.2.7 转化大肠杆菌DH5a  76
    6.2.8 重组转化子的鉴定  76-77
    6.2.9 重组质粒的测序  77
    6.2.10 重组表达质粒导入酵母和阳性转化子的筛选  77-78
    6.2.11 甲醇利用型的鉴定  78-79
    6.2.12 转化菌株的诱导表达  79
    6.2.13 表达蛋白的检测  79
  6.3 实验结果  79-84
    6.3.1 重组质粒pPICZaA-EFP的构建和鉴定  79-80
    6.3.2 pPICZaA-EFP转化毕赤酵母GS115和阳性克隆的鉴定  80-81
    6.3.3 阳性转化子甲醇利用型的鉴定  81-82
    6.3.4 重组酵母的诱导表达及SDS-PAGE电泳分析  82-83
    6.3.5 重组表达蛋白的活性测定  83
    6.3.6 Western blot分析诱导表达蛋白  83-84
  6.4 讨论  84-86
本文主要结论  86-87
参考文献  87-92
附录  92-95
个人简历和论文情况  95-96
致谢  96

地鳖虫纤溶活性蛋白抗血栓、抗肿瘤及其基因克隆与表达的研究

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