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基于~1H-NMR技术对道地药材黄柏和泽泻质量控制的代谢组学研究

作　者: 罗尚华
导　师: 张艺
学　校: 成都中医药大学
专　业: 药物化学
关键词: 黄柏泽泻质量控制代谢组学 ~1H-NMR
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

中药是复杂混合物体系,由于其基源繁多,产地各异,作用机制复杂,生产炮制加工的多样性等因素,使得中药质量控制与评价是中药研究中的难点。基于中医理论的整体观念和随着现代分析化学技术的发展,色谱指纹图谱技术已广泛用于中药材及其制剂的质量控制与评价,尤其1H-NMR指纹图谱能够同时检测植物的初生和次生代谢产物,是全组分研究不可或缺的方法。多产地或多基源品种是道地药材质量控制的难点,且目前对泽泻、黄柏的质量控制的方式单一,多采用HPLC法测定药材中单个或多个有效成分的含量,不足以体现中药材多组分、多靶点的特点,急需寻求新的质量控制方法对不同产地泽泻药材以及不同品种黄柏药材进行系统研究。本实验室前期已将1H-NMR代谢组学技术成功运用于黄连、藏茵陈的品种鉴别与品质评价研究,本文将1H-NMR的代谢组学技术用于区分泽泻产地、鉴别黄柏品种,旨在加强道地药材黄柏、泽泻的质量控制。目的：以道地药材泽泻和黄柏为研究对象,采用1H-NMR的代谢组学方法,研究不同产地、不同品种间药材代谢物的差异和进行质量评价,为泽泻药材产地的判别、黄柏药材的品种鉴定以及质量控制提供科学依据。方法：1.采用1H-NMR代谢组学技术,建立泽泻药材Alisma orientalis(Sam.) Juzep.和黄柏药材(黄皮树Phellodendron chinense Schneid.、秃叶黄皮树P. chinense var. glabriusculum Schneid.、黄檗P. amurense Rupr.)的整体代谢物指纹图谱,结合化学计量学中的主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)方法,以揭示药材整体代谢物差异。2.采用HPLC法测定川黄柏与关黄柏药材中小檗碱、黄柏酮等5个有效成分的含量,并结合方差分析,验证1H-NMR代谢组学分析结果。结果：1.从泽泻提取物中鉴定了4个成分：23-乙酰泽泻醇B (δ2.09,3H,s,-OAc; δ1.15,3H, s, H-18)、蔗糖(5.39,d,H-1)、p-半乳糖(54.52,d,H-1)、丙氨酸(δ1.47, d,-CH3).通过PCA、PLS-DA分析,能有效区分4个不同产地泽泻药材；经核磁定量分析,泽泻药材中4个代谢成分(23-乙酰泽泻醇B、蔗糖、p-半乳糖、丙氨酸的相对含量分别为0.07%～0.19%,0.67%-6.58%,0.20%-0.56%,0.09%-0.18%。以23-乙酰泽泻醇B为质量评价指标,发现四川产地的泽泻药材中含有最多的23-乙酰泽泻醇B,相对含量高达0.19%,因此判断其质量最佳。2.从川黄柏和关黄柏提取物中鉴定了11个成分：小檗碱、巴马汀、绿原酸、阿魏酸、黄柏酮、木兰花碱、黄柏碱、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸。PCA、PLS-DA得分图显示川黄柏与关黄柏药材有明显的区分效果，而川黄柏的2个基源品种黄皮树与秃叶黄皮树聚集一起,不能有效区分。通过载荷图分析发现关黄柏中含有更多的木兰花碱、巴马汀、黄柏酮、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸以及部分未鉴定的糖;川黄柏中含有更多的小檗碱、黄柏碱、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸。部分代谢产物被选择手动积分,进行定量分析,川黄柏中小檗碱、黄柏碱、咖啡酸、绿原酸、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖的相对含量分别为：3.47%、0.44%、0.20%、2.02%、1.30%、0.32%、0.42%；关黄柏中小檗碱、巴马汀、黄柏碱、黄柏酮、绿原酸、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖的相对含量分别为：0.50%、0.33%、0.15%、0.15%、0.52%、1.58%、0.36%、0.50%。3. HPLC含量测定结果为：川黄柏中小檗碱、黄柏碱、木兰花碱的含量分别为5.40%、0.46%、0.11%;关黄柏中小檗碱、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、黄柏酮的含量分别为：0.44%、0.09%、0.31%、0.31%、0.18%。经过方差分析，黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、小檗碱、黄柏酮5个成分在川黄柏与关黄柏中具有显著性差异,这与1H-NMR代谢组学化学计量学分析结果一致。结论：1.四个不同产地的泽泻药材代谢产物有明显差异，23-乙酰泽泻醇B、蔗糖、β-半乳糖、丙氨酸成为泽泻药材地缘区分的差异代谢物。以23-乙酰泽泻醇B为评价指标,四川产地泽泻药材质量最佳,与传统上认为四川为泽泻的道地产区相符。2.川黄柏与关黄柏药材代谢产物有明显差异。小檗碱、巴马汀、黄柏碱、木兰花碱、黄柏酮、阿魏酸、咖啡酸和绿原酸成为区分川黄柏与关黄柏药材的差异代谢物；川黄柏药材的2个基源品种(黄皮树与秃叶黄皮树)整体代谢成分无明显差异,黄皮树资源极为稀少,建议中国药典将秃叶黄皮树作为川黄柏收载。

全文目录

摘要  2-5
Abstract  5-8
目录  8-11
英文缩写词对照表  11-12
引言  12-15
第一章泽泻药材的~1H-NMR 代谢组学研究  15-30
  1. 仪器、软件和材料  15-17
  2 方法与结果  17-28
    2.1 23-乙酰泽泻醇B~1H-NMR图谱测定  17-18
    2.2 ~1H-NMR测定条件  18
    2.3 供试品溶液的制备  18-19
    2.4 ~1H-NMR图谱处理与数据处理  19
    2.5 方法学考察  19-20
    2.6 ~1H-NMR信号归属及代谢物鉴定  20-21
    2.7 基于多元统计分析方法不同产地泽泻代谢成分的差异研究  21-24
    2.8 四个代谢成分相对含量测定及方差分析  24-28
  3 小结与讨论  28-30
第二章黄柏药材的~1H-NMR代谢组学研究  30-56
  1. 仪器、软件和材料  30-32
  2. 方法与结果  32-54
    2.1 对照品化学结构~1H-NMR图谱测定与信号归属  32-34
    2.2 ~1H-NMR测定条件  34-35
    2.3 供试品溶液的制备  35-36
    2.4 ~1H-NMR图谱处理与数据出处理  36
    2.5 方法学考察  36-37
    2.6 ~1H-NMR信号归属  37-40
    2.7 基于多元统计方法川黄柏与关黄柏代谢成分差异的研究  40-44
    2.8 部分代谢产物相对含量测定及方差分析  44-54
  3 小结与讨论  54-56
第三章 HPLC测定川黄柏与关黄柏中有效成分的含量  56-69
  1 仪器、试剂与材料  56
  2 对照品溶液的制备  56-57
  3 色谱条件的考查  57-59
    3.1 波长的选择  57-58
    3.2 流动相的选择  58
    3.3 色谱柱的考查  58
    3.4 色谱条件的确定  58-59
  4 供试品溶液的制备  59-61
    4.1 提取方式的考查  59
    4.2 提取溶媒的考察  59-60
    4.3 提取溶媒用量的考察  60
    4.4 提取时间的考察  60
    4.5 供试品溶液的制备方法  60-61
  5 线性关系考察  61-62
  6 方法学考察  62-66
    6.1 精密度试验  62-63
    6.2 重复性试验  63
    6.3 稳定性试验  63-64
    6.4 加样回收率实验  64-66
  7 样品含量测定  66-68
  8 ANOVA分析  68
  9 小结讨论  68-69
第四章总结与讨论  69-72
  1 总结  69
  2 讨论  69-70
  3 创新点  70-71
  4 展望与不足  71-72
参考文献  72-76
综述  76-82
  参考文献  80-82
附图  82-86
致谢  86-87
在读期间公开发表的学生论文、专注及科研成果  87-88

基于~1H-NMR技术对道地药材黄柏和泽泻质量控制的代谢组学研究

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