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贝类中诺如病毒的风险评估及与组织血型抗原相关性

作　者: 马丽萍
导　师: 周德庆
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水产品加工及贮藏工程
关键词: 贝类诺如病毒污染状况调查组织血型抗原表达调控风险评估
分类号: S944
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

诺如病毒（Noroviruses，NoVs）是引起世界范围内非细菌性急性肠胃炎的主要病原体，贝类是其最主要的传播载体。人们通常由于食用了生的或者加热不彻底的海产贝类而感染NoVs，并引起急性肠胃炎。我国是世界水产大国，贝类年产量1000多万吨，在我国国民经济中占有较重要的地位，NoVs作为贝类中常见的食源性致病微生物是质量安全一个不容忽视的问题。然而，NoVs尚不可体外培养，贝类中因NoVs含量少、存在PCR抑制剂多等原因给检测带来困难，我国尚未建立贝类中NoVs检测的国家标准；研究表明组织血型抗原是人体感染NoVs的受体，牡蛎中也存在类似的受体，但牡蛎中该受体与NoVs的相关性及其对牡蛎富集NoVs的影响尚不清楚。因此建立贝类中NoVs的富集检测方法，调查我国主要沿海地区贝类中NoVs的分布情况以及开展贝类中NoVs的风险评估；研究牡蛎中NoVs与组织血型抗原相关性，探索牡蛎等贝类富集NoVs的机理，对于保护消费者健康，保障我国贝类产业可持续健康发展具有重要的意义。本文以贝类中NoVs为研究对象，优化建立了海产贝类中GI和GII型NoVs的富集方法，调查了黄渤海区7个城市零售海产贝类中NoVs的污染状况，在上述研究的基础上，结合CAC的食品安全风险分析理论，开展贝类中NoVs的风险评估研究；针对NoVs受体，建立了太平洋牡蛎中A型组织血型抗原的ELISA检测方法，并调查了威海、青岛、日照3个城市太平洋牡蛎样品中A型组织血型抗原随季节的变化规律；利用RACE技术得到了一个太平洋牡蛎组织血型抗原合成相关基因FUT3的cDNA全长，并进行了原核表达；利用牡蛎全基因组序列，初步探索了温度对牡蛎组织学型抗原合成关键基因FUT2的表达调控。具体研究结果如下：1．贝类中NoVs富集方法的建立和优化通过人工污染实验，向牡蛎和菲律宾蛤仔的消化道匀浆物中分别添加不同浓度的GI.3和GII.4型NoVs，利用4种贝类中NoVs富集方法分别回收病毒，用实验室前期建立的real-time RT-PCR方法进行检测。以4种方法从牡蛎和菲律宾蛤仔中富集GI.3和GII.4型NoVs的富集效率评价4种方法的优劣，同时分析影响NoVs富集的主要因素。结果显示方法B（Proteinase K-PEG8000）操作简单，耗时较短，且稳定性和灵敏性均优于其他方法，其从牡蛎和菲律宾蛤仔中富集GI.3型NoVs的富集效率分别为9.3%和9.6%，对GII.4型NoV的富集效率分别为13.1%和12.3%，比其他三种方法的富集效率高（p<0.05）。研究结果还发现贝类品种及贝类中NoVs的含量是影响贝类中NoVs富集效率的主要因素。2．黄渤海贝类中NoVs污染状况调查从2009年12月至2011年11月，采集了大连、莱州、烟台、威海、青岛、日照、连云港7个黄渤海区沿海城市6种零售贝类样品840个。调查结果显示NoVs在6种贝类中均有检出，平均检出率为13.33%(112/840)。不同贝类中NoVs的检出率为：牡蛎19.35%，紫贻贝16.67%，扇贝5.70%，缢蛏8.82%，毛蚶13.74%，菲律宾蛤仔16.44%。贝类中NoVs的季节分布结果显示，夏季贝类中NoVs检出率最高，为16.44%，冬季和秋季次之，春季最低。此外，研究发现不同季节NoVs检出率存在明显的品种特异性差异。春季和冬季牡蛎样品中NoVs的检出率最高，夏季毛蚶样品中NoVs的检出率最高，而冬季菲律宾蛤仔中NoVs的检出率最高。在冬季采集的33个扇贝样品中，NoVs无检出。定量结果显示，112个阳性贝类样品中，96个样品中NoVs含量<103基因拷贝。运用spss17.0软件对不同贝类品种和不同季节贝类中NoV污染水平进行分析，非参检验（Kruskal-Wallis H tests）结果显示不同贝类品种和不同季节贝类中NoV污染水平均无明显差异(p>0.05)。112个阳性样品中，普通RT-PCR复检中仅96个样品琼脂糖凝胶电泳显示目的条带。将这96个样品测序结果输入Norovirus GenotypingTool Version1.0软件后，结果显示94个NoV属于GII.12变异株，2个属于GI.3。在冬季采集的菲律宾蛤仔和毛蚶中检测到GI.3型NoV。3．贝类中NoVs的风险评估本研究针对上述情况，利用前期调查研究获得的贝类中NoVs污染状况数据和相关膳食调查数据，对我国海产贝类中NoVs进行了定量风险评估，研究结果发现我国沿海城市居民食用贝类引发肠胃炎的平均概率为4.08E-7，预计每年0-4岁、5-64岁和65岁以上人口的发病数分别为119、9078和339人。本次评估只考虑贝类中NoVs污染率和污染水平以及贝类摄入量对风险的影响，存在一定的不确定性。国内外有关贝类中NoVs风险评估的研究较少，本次评估可以为贝类或其他食品中NoVs的风险评估提供一定的参考，相关调查资料可以为贝类食用安全提供指导意义。4．牡蛎组织血型抗原的检测在实验室前期研究的基础上改进前处理方法，建立了太平洋牡蛎中A型组织血型抗原的ELISA检测方法。运用建立的ELISA方法和第二章建立的贝类中NoVs的富集方法对2010年从威海、青岛、日照3个城市采集的36份太平洋牡蛎进行了A型组织血型抗原和NoVs的检测，结果表明三个城市太平洋牡蛎中A型组织血型抗原随季节变化呈现波动性变化，在全年不同月份出现峰值；36份牡蛎样品检出NoVs阳性6份，检出率为16.7%，且检出时间出现在A型组织血型抗原的高峰值处，推测贝类受NoVs污染可能与组织血型抗原表达相关。5.牡蛎组织血型抗原相关基因的克隆及原核表达参照人体组织血型抗原合成途径，选择FUT2基因作为牡蛎组织血型抗原合成关键基因。由于当时牡蛎全基因组序列尚未公布，通过Clustal X与Mega等分析软件，分析人、猩猩、小鼠、家犬等物种的FUT2基因氨基酸序列，推测牡蛎FUT2的保守区，根据保守序列设计引物。利用PCR方法扩增牡蛎组织血型抗原合成相关基因得到预期片段488bp的扩增产物，通过牡蛎“FUT2”扩增片段与人、小鼠、猩猩等物种的序列比对分析，可以初步证实牡蛎证实在牡蛎基因组中存在FUT2基因的保守片段。根据PCR方法得到的牡蛎“FUT2”的部分序列，设计引物，利用RACE扩增技术对牡蛎基因组进行扩增，克隆测序得到牡蛎“FUT2”基因3’和5’端序列，序列拼接后得到1086bp的cDNA全长基因。2012年9月，太平洋牡蛎全基因组序列公布，通过比对发现得到的牡蛎“FUT2”蛋白序列与FUT3基因同源性为98%，而与牡蛎FUT2基因的同源性为36%，因此证实所得序列为太平洋牡蛎FUT3基因。在此基础上，通过构建表达载体，成功诱导出FUT3的蛋白，大小为41.5kDa，为后续FUT3基因的功能验证打下基础。6．温度对牡蛎组织血型抗原的表达调控以β-actin作为内参基因，建立太平洋牡蛎中FUT2基因的荧光定量PCR检测方法。用高温（28℃）和低温（4℃）处理太平洋牡蛎，分别于48h和72h取样，研究牡蛎外套膜、闭壳肌、鳃和内脏4个组织中7组FUT2基因的表达情况。荧光定量PCR研究结果表明温度对FUT2部分基因的表达存在一定的影响。高温和低温条件，FUT2部分基因存在表达上调的现象。7组基因中，高温胁迫时FUT2.1和FUT2.3基因在牡蛎4个不同组织中表达上调；低温胁迫时，FUT2.4在外套膜和鳃组织中表达上调。

全文目录

摘要  2-7
ABSTRACT  7-15
引言  15-17
第一章文献综述  17-34
  1.1 NOVS简介  17-20
    1.1.1 NoVs基因组结构  17-19
    1.1.2 NoVs的分类  19
    1.1.3 我国NoVs的流行状况  19-20
  1.2 贝类中的NOVS  20-23
    1.2.1 贝类中NoVs的来源  20-21
    1.2.2 贝类引起的NoVs暴发  21-23
  1.3 组织血型抗原研究进展  23-26
    1.3.1 NoVs受体人类组织血型抗原研究进展  24-25
    1.3.2 牡蛎组织血型抗原研究进展  25-26
  1.4 食源性微生物风险评估概述  26-33
    1.4.1 微生物风险评估的基本组成  27
    1.4.2 微生物风险评估的分类  27-28
    1.4.3 食源性微生物风险评估的基本原则  28
    1.4.4 食源性致病微生物风险评估的程序  28-30
    1.4.5 国内外食源性致病微生物风险评估的研究进展  30-32
    1.4.6 食源性致病微生物定量风险评估存在的问题  32-33
    1.4.7 对食源性致病微生物定量风险评估的几点建议  33
  1.5 本文研究的目的和意义  33-34
第二章贝类中 NOVS 富集方法的建立与优化  34-46
  2.1 实验材料  34-35
    2.1.1 实验菌株  34
    2.1.2 样品  34
    2.1.3 实验试剂  34-35
    2.1.4 实验仪器  35
  2.2 实验方法  35-39
    2.2.1 贝类中 NoVs 富集方法的比较  35-37
    2.2.2 病毒RNA提取  37
    2.2.3 引物序列  37
    2.2.4 RT-PCR方法  37-38
    2.2.5 Real-time RT-PCR方法  38-39
    2.2.6 数据分析  39
  2.3 结果与分析  39-44
    2.3.1 荧光定量方法的特异性和灵敏度  39-40
    2.3.2 定量方法的标准曲线  40
    2.3.3 四种方法对GI.3型NoV的富集效率  40-42
    2.3.4 四种方法对GII.4型NoV的富集效率  42-44
    2.3.5 四种方法对GI.3和GII.4型NoVs富集效率的比较  44
  2.4 讨论与小结  44-46
第三章黄渤海贝类中NOVS的污染状况调查  46-53
  3.1 实验材料  46-47
    3.1.1 样品  46-47
    3.1.2 实验仪器  47
    3.1.3 实验试剂  47
  3.2 实验方法  47-49
    3.2.1 样品处理方法  47-48
    3.2.2 病毒富集方法  48
    3.2.3 RNA提取方法  48
    3.2.4 病毒检测方法  48
    3.2.5 病毒分型方法  48-49
    3.2.6 数据分析  49
  3.3 结果与分析  49-51
    3.3.1 不同贝类中 NoVs 的检出情况  49
    3.3.2 不同季节贝类中 NoVs 污染状况  49-50
    3.3.4 贝类中NoV的定量检测  50-51
    3.3.5 贝类中NoVs的分型  51
  3.4 讨论与小结  51-53
第四章贝类中NOVS的定量风险评估  53-76
  4.1 资料来源  53-55
    4.1.1 样品资料  53
    4.1.2 贝类摄入量资料  53-54
    4.1.3 人口资料  54
    4.1.4 风险评估方法  54-55
  4.2 结果与分析  55-71
    4.2.1 危害识别  55-58
    4.2.2 危害描述  58-60
    4.2.3 暴露评估  60-68
    4.2.4 风险描述  68-71
  4.5 风险管理  71-73
    4.5.1 污染来源的控制  71-72
    4.5.2 贝类产品的控制  72
    4.5.3 切断其他传播途径  72
    4.5.4 风险管理措施  72-73
  4.6 贝类中 NOVS风险评估的不确定性分析  73-74
    4.6.1 风险评估的确定性  73
    4.6.2 风险评估的不确定性  73-74
  4.7 讨论与小结  74-76
第五章牡蛎组织血型抗原的检测  76-84
  5.1 牡蛎 A 型组织血型抗原 ELISA 方法的建立  76-83
    5.1.1 试验材料  76-77
    5.1.2 试验方法  77-79
    5.1.3 结果与分析  79-83
  5.2 讨论与小结  83-84
第六章牡蛎组织血型抗原相关基因的克隆与原核表达  84-102
  6.1 牡蛎 HBGAS相关基因的 PCR 扩增  84-88
    6.1.1 试验材料  84-85
    6.1.2 实验方法  85-87
    6.1.3 结果分析  87-88
  6.2 RACE 法扩增牡蛎 HBGAS合成相关基因及其生物信息学分析  88-95
    6.2.1 试验材料  88
    6.2.2 试验试剂  88-89
    6.2.3 实验方法  89-91
    6.2.4 结果分析  91-95
  6.3 FUT3 基因的原核表达  95-100
    6.3.1 试验材料  95
    6.3.2 试验试剂  95
    6.3.3 试验仪器  95-96
    6.3.4 试验方法  96-98
    6.3.5 试验结果  98-100
  6.4 小结  100-102
第七章温度对牡蛎组织血型抗原FUT2基因的表达调控  102-111
  7.1 牡蛎 HBGA 合成关键基因 FUT2REAL-TIME PCR检测方法的建立  102-109
    7.1.1 试验材料  102
    7.1.2 试验仪器  102-103
    7.1.3 试验方法  103-104
    7.1.4 结果分析  104-109
  7.2 小结  109-111
结论  111-112
参考文献  112-127
致谢  127-128
在学期间发表的学术论文及著作  128

贝类中诺如病毒的风险评估及与组织血型抗原相关性

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