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HDAC1特异性抑制Runx2介导的OPN的转录活性

作　者: 张忠丽
导　师: 刘文广
学　校: 东北师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 基因表达调控成骨细胞分化 Runx2 OPN HDAC1
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Runx2是成骨细胞分化过程中的关键转录因子之一。Runx2在诱导干细胞向成骨细胞分化过程中需要依赖染色质结构的变化和辅助因子的参与来调控Runx2与DNA的结合和Runx2的转录活性的改变。例如,抑制一种组蛋白去乙酰化酶HDAC3的活性可以显著增强骨钙蛋白基因表达、加速矿化。我们在前人关于HDACs与Runx2的相互作用的研究成果的基础上,进一步研究了HDAC1对Runx2介导的OPN的基因表达调控的影响。首先,通过荧光双报告检测实验检测了HDAC家族成员HDAC1,3,4,5,6,7,8,10,Sirt2以及HAT家族成员P300,GCN5,CBP对Runx2介导的OPN启动子活性的影响。结果发现,只有HDAC1和HDAC3对Runx2介导的OPN启动子活性有明显抑制作用;加入HDAC抑制剂TSA后,不仅这种抑制作用消失,反而加强了Runx2介导的OPN启动子活性,而且显著地抑制了HDAC1对Runx2介导的OPN启动子活性的抑制作用。为了分辨核小体结构是否参与HDAC1的这种抑制作用,我们把OPN启动子连在能产生核小体结构的质粒载体上,并同HDAC1、Runx2转入细胞中。结果表明产生核小体的载体与不产生核小体的载体相比,HDAC1抑制Runx2介导的OPN启动子活性的作用趋势是基本相同的,而且TSA的作用效果也是基本相同的。这说明HDAC1对Runx2介导的OPN启动子活性的影响与染色质结构没有关系。接下来,我们用免疫荧光(IF)和免疫共沉淀(Co-IP)实验,验证了HDAC1与Runx2共定位于细胞核中,猜测二者可能在同一复合物中。我们进一步用CHIP实验证实,HDAC1和Runx2都能结合到OPN的启动子上。我们通过将HDAC1瞬时转染到过表达Runx2的细胞株中发现,HDAC1显著抑制了Runx2诱导的OPN mRNA水平,但有趣的是,HDAC1对ALP mRNA水平没有影响。在HDAC1的酶活性被TSA抑制后,Runx2诱导的OPN mRNA水平明显上升,但同时Runx2诱导的ALP mRNA水平不变。这些结果说明HDAC1抑制Runx2诱导的OPN mRNA水平的作用和HDAC1抑制Runx2激活OPN启动子活性的作用是一致的,并且这种作用具有一定的特异性。我们的免疫印迹结果显示,在诱导成骨细胞分化的第6天后,细胞中OPN的mRNA水平明显提高,与此同时HDAC1蛋白水平减弱。不仅如此,我们还同时分析了多种不同细胞系的HDAC1蛋白水平,发现随着分化程度的不断深入,其HDAC1蛋白水平也呈逐步减弱的趋势。以上结果表明,在Runx2上调OPN mRNA的水平甚至在Runx2诱导成骨细胞分化的过程中,HDAC1可能起到一种抑制性的屏障作用,当Runx2通过了这个屏障后,HDAC1就不会再对OPN的表达起到明显抑制作用,从而促进Runx2的调控作用。另外,我们还发现HDAC1对Runx2的蛋白水平没有影响,而Runx2的蛋白水平却随着分化而明显增加,因此我们猜测在成骨细胞分化过程中,可能存在HDAC1以外的某种表观遗传调控机制调控Runx2的蛋白质水平,从而影响成骨细胞分化。我们的研究初步地揭示了HDAC1抑制Runx2诱导的OPN mRNA水平的分子机制,为人们利用HDACs来治疗骨骼疾病提供了一定的理论基础。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-10
引言  10-16
  一、研究背景  10-15
    （一）骨的发育  10-11
    （二）影响骨发育的重要转录因子Runx2  11-13
    （三） HDACs 在骨发育中的作用  13-14
    （四）骨发育中骨桥蛋白（OPN）的表达调控  14-15
  二、研究内容与意义  15-16
材料与方法  16-25
  一、实验材料  16-20
    （一）细胞及培养试剂  16
    （二）质粒  16
    （三）抗体  16-17
    （四）试剂  17
    （五）引物  17-18
    （六）仪器设备  18
    （七）部分试剂的配制方法  18-20
  二、实验方法  20-25
    （一）细胞培养  20-21
    （二）蛋白质的提取和制备  21
    （三） Western Blot  21
    （四）免疫荧光  21-22
    （五） ALP 染色  22
    （六） RT-PCR  22-23
    （七）质粒小量制备  23
    （八） pREP4-pOPN-Luc 构建质粒  23
    （九）瞬时转染  23
    （十）双报告  23-24
    （十一）免疫沉淀（IP）  24
    （十二）染色质免疫共沉淀技术（CHIP）  24-25
结果与分析  25-32
  一、HDACS与HATS 对RUNX2 上调OPN 启动子活性的影响  25-26
  二、HDAC1 和HDAC3 能抑制RUNX2 转录激活活性  26-27
  三、HDAC1 抑制RUNX2 调控的OPN 启动子活性不依赖染色质结构  27-28
  四、RUNX2 和HDAC1 共定位，并且同时占据在OPN 启动子上  28-29
  五、HDAC1 抑制RUNX2 活性改变OPNMRNA 水平  29-30
  六、在成骨细胞分化过程中HDAC1 的蛋白水平略有下降  30-32
讨论  32-34
  一、HDAC1 特异性抑制RUNX2 介导的OPN 转录活性  32-33
  二、HDAC1 与 Runx2 结合在 OPN 启动子上，HDAC1 在成骨细胞分化过程中蛋白水平的表达略有下降  33-34
结论  34-35
参考文献  35-39
致谢  39

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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