学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

作　者: 隋立军
导　师: 赫崇波
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 文蛤 C1q cDNA克隆荧光定量PCR 重组蛋白
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 2次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

补体系统的经典途径是无脊椎动物免疫的第一道防线。C1q是经典补体途径的目标识别蛋白,对清除病原体和凋亡细胞至关重要。C1q能够通过它自身的异源三聚球状C1q结构域广泛地结合“自己”和“非己”的配体,引起经典途径。文蛤(Meretrix meretrix)属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Lamellibranchia)、异齿亚纲(Heterodonta)、帘蛤目(Veneroida)、帘蛤科(Veneridae)、文蛤属(Meretrix),是一种重要的经济贝类,也是我国主要出口的鲜活水产品之一。本文采用基因克隆的方法,得到了文蛤C1q基因(MmC1q) cDNA全长序列(GenBank收录号HQ850699), MmClq基因全长为1,213bp,5’端非编码区(UTR)为316bp,3’UTR为372bp,在polyA尾上游43bp处存在加尾信号序列AATAAA。开放阅读框525bp,编码174个氨基酸。MmClq氨基酸序列N端含有一个信号肽序列和一个典型的Clq结构域(第26-163位)。MmClq蛋白的空间结构预测发现,MmClq结构域是由9个B折叠形成的,含8个保守的氨基酸残基(Phe33, Try55, Asn60, Phe69, Gly75,Tyr77,Phe152和G1y154),其中5个芳香族氨基酸参与形成疏水核心结构。MmClq蛋白的Clq结构域与软体动物中的唾液酸结合凝集素、两栖类动物和脊椎动物中的Clq结构域都具有较高的同源性。通过荧光定量PCR, MmC1qmRNA在文蛤肝胰脏组织中表达量最高。文蛤受鳗弧菌感染后,Clq的mRNA相对表达水平有明显的上升调节,在注射2h时,MmC1q mRNA表达量最高。我们可以推论MmClq是文蛤机体在免疫防御中重要的组织合成蛋白并且参与了对外源微生物的免疫防御效应。为了从蛋白水平上验证Clq的功能,包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组并在大肠杆菌BL21(DE3)载体中进行体外表达,利用考马斯亮蓝(Camas brilliant blue)总蛋白定量测试盒测定MmClq蛋白质量浓度为1.4867g/L,采用牛津杯法(oxfprd-cup tests)对MmClq重组蛋白进行体外抑菌试验,但是并未检测到明显的抑菌活性。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
引言  9-17
  1.1 无脊椎动物的免疫防御  9
  1.2 补体系统的概述  9-12
    1.2.1 补体系统的组成成分  9-10
    1.2.2 补体系统的激活途径  10-12
    1.2.3 补体系统的生物学功能  12
  1.3 含C1q结构域蛋白的研究概述  12-13
    1.3.1 补体成分C1q的结构及功能  12-13
    1.3.2 含C1q结构域蛋白的研究概况  13
  1.4 文蛤的病害及分子生物学研究进展  13-16
    1.4.1 我国文蛤的养殖现状及病害研究进展  14
    1.4.2 文蛤的分子生物学研究进展  14-16
  1.5 本研究的目的及意义  16-17
    1.5.1 研究目的  16
    1.5.2 研究意义  16-17
2 文蛤C1q基因的克隆与序列分析  17-25
  2.1 前言  17
  2.2 材料和方法  17-19
    2.2.1 实验用文蛤  17
    2.2.2 方法  17-19
  2.3 结果  19-23
    2.3.1 MmC1q cDNA序列分析  19-20
    2.3.2 MmC1q氨基酸序列分析  20-21
    2.3.3 MmC1q蛋白功能域预测  21
    2.3.4 C1q编码的氨基酸的同源性比对和分子进化分析  21-23
  2.4 讨论  23-25
3 文蛤C1q基因的时序表达与组织分布表达  25-33
  3.1 前言  25
  3.2 实验材料和方法  25-28
    3.2.1 实验用文蛤  25
    3.2.2 文蛤总RNA的提取  25-26
    3.2.3 反转录  26-27
    3.2.4 Real-time PCR  27-28
  3.3 结果  28-32
    3.3.1 RNA以及cDNA的检测  28-29
    3.3.2 荧光定量PCR特异性引物以及内参基因的检测  29-30
    3.3.3 菌刺激后MmC1q的相对表达  30-31
    3.3.4 MmC1q组织分布相对表达  31-32
  3.4 讨论  32-33
4 文蛤C1q基因的体外重组表达与活性研究  33-44
  4.1 前言  33
  4.2 实验方法  33-39
    4.2.1 培养基和电泳缓冲液的配置  33
    4.2.2 感受态细胞的制备、连接及转化  33-34
    4.2.3 重组质粒的构建  34-36
    4.2.4 重组蛋白的表达及检测  36-37
    4.2.5 重组蛋白的纯化  37-38
    4.2.6 重组蛋白的浓度测定及活性分析  38-39
  4.3 结果  39-42
  4.4 讨论  42-44
结论  44-45
参考文献  45-50
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  50-51
致谢  51

文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

内容摘要

全文目录

相似论文