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稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因克隆、序列分析及mRNA定量检测

作　者: 黄婷妹
导　师: 蔡生力
学　校: 上海海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因组步移序列分析荧光定量
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

稀有鮈鲫（Gobiocypris rarus）是我国特有的一种小型鲤科鱼类，并已作为一种新型的模式实验鱼应用于鱼类遗传学、鱼病学、环境科学以及转基因观赏鱼等研究领域。卵黄蛋白原(vitellogenin，Vg)是卵生动物卵黄形成过程中大量存在于雌性动物血液中的富含糖、脂、磷的高分子量蛋白，是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体。本实验根据NCBI网站上公布的稀有鮈鲫卵黄蛋白原cDNA序列设计引物，通过普通PCR技术获得6299bp序列；然后以获得的6299bp序列的5’端为模板，设计两对引物，通过基因组步移技术克隆得到1285bp的序列。经过Seqman拼接软件后得到7573bp序列，其中卵黄蛋白原基因全序列长6595bp，上游调控序列978bp。经开放性阅读框分析得到：稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因含有26个外显子和25个内含子，编码1299个氨基酸序列，CDS长3900bp。将稀有鮈鲫卵黄蛋白原cDNA基因序列进BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性分析，结果发现：所得的序列与斑马鱼、鲮、喀拉鲃、唐鱼、锦鲤卵黄蛋白原基因cDNA序列的相似性分别为69%、88%、87%、63%、70%；经预测得到的稀有鮈鲫卵黄蛋白原氨基酸序列，与斑马鱼、鲮、喀拉鲃、唐鱼、锦鲤卵黄蛋白原氨基酸序列进行比对，相似性分别为76%、85%、91%、82%、88%。通过开放性阅读框分析，还发现，与斑马鱼相比，稀有鮈鲫卵黄蛋白原中插入了一段序列，长度为21bp，位于第1外显子和第3外显子之间，可能导致7个氨基酸序列的插入；另外，稀有鮈鲫卵黄蛋白原第22个外显子（252bp）比斑马鱼卵黄蛋白原第21个外显子（312bp）少了一段60bp的序列。将稀有鮈鲫和斑马鱼卵黄蛋白原基因序列均去除内含子，分别得到4212bp（稀有鮈鲫）和4256bp（斑马鱼）的卵黄蛋白原基因编码区，两者比较后发现相似性为69%。经BLAST比对发现，稀有鮈鲫卵黄蛋白原上游调控序列中220bp-838bp区间与朝鲜鱊（Acheilognathus yamatsutae）卵黄蛋白原基因启动子序列2857bp-3144bp区间有80%相似性。根据稀有鮈鲫卵巢的发育情况，可以将稀有鮈鲫的卵巢分为六期。本实验以稀有鮈鲫卵巢发育三个不同时期,卵黄发生前期（第I期）、卵黄发生期（第II期）、卵巢成熟后期（第III期）为研究对象，取肝脏组织提取RNA，通过荧光定量PCR技术检测稀有鮈鲫卵黄蛋白原的mRNA在三个时期内的定量表达。结果发现，在肝脏中，随着卵巢的发育，在第II期中卵黄蛋白原m RNA的表达量最高，相对表达量达到25.202，而第I期和第III期较低，仅2.4和1.0。本研究结果为丰富鱼类繁殖发育生物学，进一步探索稀有鮈鲫这一具有重要研究价值的鱼类提供科学依据。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
引言  11-18
  1 稀有鮈鲫研究现状  11-12
  2 鱼类卵黄蛋白原研究现状  12-14
    2.1 卵黄蛋白原的结构  12-13
    2.2 卵黄蛋白原的种类  13
    2.3 卵黄蛋白原的功能  13-14
  3 基因克隆方法介绍  14-17
  4 实时荧光定量 PCR  17-18
第一章稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因序列的克隆与析  18-40
  1．实验材料和方法  18-28
    1.1 材料  18-20
      1.1.1 实验动物  18
      1.1.2 菌株和克隆载体  18
      1.1.3 主要试剂和试剂盒  18-19
      1.1.4 主要仪器  19-20
    1.2 实验方法  20-28
      1.2.1 稀有鮈鲫基因组 DNA 的提取  20
      1.2.2 DNA 质量检测  20
      1.2.3 构建稀有鮈鲫基因组文库  20-23
        1.2.3.1 稀有鮈鲫基因组 DNA 的酶切检测  21
        1.2.3.2 稀有鮈鲫基因组 DNA 的大量酶切  21-22
        1.2.3.3 基因组 DNA 酶切产物的纯化  22
        1.2.3.4 纯化后的酶切产物与 GENOMEWALKERADAPTOR 连接  22-23
      1.2.4 引物设计与合成  23
      1.2.5 PCR 扩增和扩增产物检测  23-24
      1.2.6 PCR 产物回收与 T 载体连接  24-26
      1.2.7 序列拼接  26
      1.2.8 巢式 PCR  26-27
      1.2.9 序列分析  27-28
  2.结果与分析  28-38
    2.1 稀有鮈鲫基因组 DNA 完整性与纯度的检测  28
    2.2 克隆结果  28-29
    2.3 稀有鮈鲫卵黄蛋白原 5'端基因步移结果  29-30
    2.4 稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因序列分析  30-37
    2.5 稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因上游调控序列分析  37-38
    2.6 稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因序列分析  38
  3 讨论  38-40
    3.1 稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因与斑马鱼卵黄蛋白原基因的比较  38-40
    3.2 稀有鮈鲫卵黄蛋白原上游调控因子  40
第二章稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因在卵巢发育不同时期表达情况定量分析  40-53
  1.实验材料和方法  41-46
    1.1 实验材料  41
      1.1.1 实验动物  41
      1.1.2 主要仪器  41
    1.2 实验方法  41-46
      1.2.1 稀有鮈鲫肝脏样品采集分期  41-42
      1.2.2 总 RNA 的提取  42
      1.2.3 甲醛变性胶电泳  42-43
      1.2.4 CDNA 的合成  43-45
      1.2.5 引物的设计以及合成  45
      1.2.6 引物检测  45-46
      1.2.7 荧光定量 PCR 检测  46
  2．结果  46-51
    2.1 RNA 完整性分析  46-47
    2.2 RT-PCR 序列以及保守性分析  47-48
      2.2.1 内参引物的验证结果  47-48
      2.2.2 目的引物验证结果  48
    2.3 荧光定量 PCR 分析  48-51
      2.3.1 荧光定量 PCR 特异性分析  48-49
      2.3.2 稀有鮈鲫卵黄蛋白原 M RNA 荧光定量 PCR 标准曲线  49-50
      2.3.3 卵黄蛋白原 MRNA 基因各时期相对表达量分析  50-51
  3 讨论  51-53
小结  53-54
参考文献  54-59
致谢  59

稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因克隆、序列分析及mRNA定量检测

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