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中华绒螯蟹Δ6与Δ9去饱和酶在脂肪酸合成过程中的作用初探及延伸因子EF-1δ和EF-2的初步研究

作　者: 郭子好
导　师: 成永旭
学　校: 上海海洋大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 中华绒螯蟹 Δ6 Δ9去饱和酶基因 EF-1、EF-2基因克隆肝胰腺表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本试验采用RT-PCR和RACE方法，首次克隆了中华绒螯蟹 Δ6、Δ9去饱和酶基因全长cDNA序列，Δ6去饱和酶cDNA全长2278bp，编码442个氨基酸；Δ9去饱和酶全长2419bp，编码347个氨基酸。利用实时荧光定量PCR法对Δ6和Δ9去饱和酶基因在中华绒螯蟹各组织中的表达进行分析。结果显示Δ6和Δ9去饱和酶基因mRNA在各组织中广泛表达，在肝胰腺和脑神经节组织中表达量最高。本试验为研究不同脂肪源饲料喂养中华绒螯蟹对去饱和酶基因表达的影响，特设计了一个养殖试验。用四种不同比例鱼油和豆油的饲料喂养幼蟹238天，油脂添加量为配合饲料量的3%，添加油脂分别为全鱼油(FO)、鱼油豆油比例为1:1(FO/SO)、全豆油(SO)以及对照组(Control)，其中对照组添加的为配合饲料量3%的基础脂肪酸。分别在养殖第168天和238天采集中华绒螯蟹肝胰腺样品。结果表明在这两次不同采样时间喂养SO饲料的蟹肝胰腺中Δ6去饱和酶mRNA表达量较喂养FO饲料的蟹肝胰腺中Δ6去饱和酶mRNA表达量均高。喂养SO饲料的蟹肝胰腺中Δ6去饱和酶mRNA在喂养238天后的表达量是喂养168后的表达量的2.45倍，而喂养FO饲料的蟹肝胰腺中Δ6去饱和酶mRNA在喂养238天和喂养168天后的表达量则基本保持不变。在Δ9去饱和酶的研究中发现，从大眼幼体发育成成蟹的过程中，其mRNA在肝胰腺组织中表达有一个明显增加的趋势。使用不同配合饲料喂养中华绒螯蟹168天后对肝胰腺中Δ9去饱和酶的表达量进行测定，结果发现用FO饲料喂养的中华绒螯蟹Δ9去饱和酶mRNA在肝胰腺中的表达量显著高于用SO饲料喂养的中华绒螯蟹。延伸因子（elongation factor, EF）是参与蛋白合成过程中肽链延伸的蛋白因子，包括延伸因子EF-1和延伸因子EF-2。延伸因子EF-1由、β、γ和四个亚基组成，在蛋白翻译过程中起着关键性作用。在本试验中，我们采用RT-PCR和RACE方法克隆了中华绒螯蟹延伸因子EF-1和EF-2基因全长cDNA。序列分析表明,中华绒螯蟹EF-1cDNA全长933bp，编码263个氨基酸； EF-2全长2752bp，编码846个氨基酸。经BLASTN和BLASTX软件分析表明，此EF-1cDNA核苷酸序列与非洲爪蟾EF-1核苷酸序列的同源性最高,其相似性为70%；所编码的氨基酸序列与大红斑蝶EF-1的氨基酸序列相似性为54%。聚类分析表明,中华绒螯蟹EF-1的氨基酸序列与鱼虱EF-1聚为一支。此EF-2核苷酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2序列的同源性最高，其相似性为88%；所编码的氨基酸序列与甲壳动物EF-2的氨基酸序列相似性都在90%以上。聚类分析显示，中华绒螯蟹EF-2的氨基酸序列与镶边拟蠢蟹EF-2聚为一支，并与其它甲壳动物聚为一体。荧光定量PCR结果显示，EF-1在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高，精巢、肝胰腺中有少量表达，心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达。不同发育状态的中华绒螯蟹EF-1在肌肉组织中表达量均显著高于肝胰腺和鳃组织中表达量(P<0.05)；3个不同发育状态蟹EF-1在肌肉中的表达量也呈显著性差异(P<0.05)，其在早熟蟹肌肉中表达量最高，正常成熟蟹肌肉中次之，幼蟹肌肉中最低；不同发育状态蟹EF-1在肝胰腺和鳃组织中的表达没有显著差异(P>0.05)。EF-2在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高，精巢、肝胰腺中有少量表达，心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达。检测了不同发育状态的幼蟹、早熟蟹和正常成熟蟹EF-2在肝胰腺、鳃以及肌肉中的相对表达情况；同时也检测了在不同pH处理下幼蟹EF-2在肝胰腺和鳃中随时间变化的相对表达情况，结果显示pH胁迫对幼蟹EF-2表达有一定的诱导效果。

全文目录

英文缩写索引  4-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章文献综述  13-22
  一、脂肪酸去饱和酶基因的研究进展  13-17
    1 引言  13
    2 脂肪酸去饱和酶的分类  13
    3 脂肪酸去饱和酶的研究近况  13-17
    4 展望  17
  二、真核生物延伸因子基因的研究  17-22
    1 真核生物延伸因子的分类  18
    2 真核生物延伸因子主要功能  18
    3 延伸因子的生理作用  18-19
    4 研究延伸因子的方法和技术  19-20
    5 真核生物延伸因子的研究  20-22
第二章中华绒螯蟹 Δ6、Δ9 去饱和酶基因的克隆及序列分析  22-41
  1 材料与方法  22-28
    1.1 试验材料  22
    1.2 主要试剂  22-23
    1.3 主要仪器  23
    1.4 相关引物  23-24
    1.5 总 RNA 的提取  24
    1.6 RT–PCR 扩增 Δ9、Δ6 去饱和酶基因的部分片段  24-25
    1.7 cDNA 末端快速克隆(RACE 反应)  25-27
    1.8 PCR 产物的克隆及鉴定  27-28
  2 结果与分析  28-39
    2.1 中华绒螯蟹Δ9 去饱和酶基因全长 DNA 的克隆及生物信息学分析  28-31
    2.2 中华绒螯蟹Δ6 去饱和酶基因全长 DNA 的克隆及生物信息学分析  31-33
    2.3 中华绒螯蟹Δ9 去饱和酶氨基酸同源性分析与系统进化树的构建  33-36
    2.4 中华绒螯蟹Δ6 去饱和酶氨基酸同源性分析与系统进化树的构建  36-39
  3 讨论  39-41
第三章中华绒螯蟹Δ9 和Δ6 去饱和酶基因的表达分析  41-53
  1 材料与方法  41-44
    1.1 试验材料  41-43
    1.2 主要试剂、器材  43
    1.3 主要仪器  43
    1.4 相关引物  43
    1.5 总 RNA 的提取  43
    1.6 实时荧光定量 PCR 法检测Δ9 和Δ6 去饱和酶基因 mRNA 时空表达模式  43-44
    1.7 数据的统计处理  44
  2 结果与分析  44-50
    2.1 标准曲线的建立  44-45
    2.2 中华绒螯蟹Δ9 去饱和酶基因 mRNA 在不同组织中的表达  45
    2.3 中华绒螯蟹Δ9 去饱和酶基因 mRNA 在不同发育阶段蟹肝胰腺组织中的表达  45-46
    2.4 不同配合饲料对中华绒螯蟹肝胰腺组织中Δ9 去饱和酶 mRNA 表达量的影响  46-47
    2.5 中华绒螯蟹Δ6 去饱和酶基因 mRNA 在不同组织中的表达  47-48
    2.6 不同配合饲料对中华绒螯蟹肝胰腺组织中Δ6 去饱和酶 mRNA 表达量的影响  48-50
  3 讨论  50-53
第四章中华绒螯蟹延伸因子 EF-1δ、EF-2 的克隆及表达分析  53-75
  1 材料与方法  53-55
    1.1 试验材料  53-54
    1.2 主要试剂  54
    1.3 相关引物  54-55
    1.4 总 RNA 的提取  55
    1.5 RT–PCR 扩增 EF-1 与 EF-2 基因的部分片段  55
    1.6 PCR 产物的克隆及鉴定  55
    1.7 Real-Time 实时荧光定量 PCR 法检测 EF-1 与 EF-2 基因在各组织的表达  55
  2 结果与分析  55-71
    2.1 中华绒螯蟹 EF-1 基因全长 DNA 的克隆  55-56
    2.2 EF-1 基因全长 cDNA 序列分析  56-58
    2.3 EF-1 基因氨基酸同源性分析以及系统进化树的构建  58-59
    2.4 中华绒螯蟹 EF-2 基因全长 DNA 的克隆  59-60
    2.5 EF-2 基因全长 cDNA 序列分析  60
    2.6 EF-2 基因氨基酸同源性分析以及蛋白系统进化树的构建  60-67
    2.7 中华绒螯蟹 EF-1 基因的表达  67-69
    2.8 中华绒螯蟹 EF-2 基因的表达  69-71
  3 讨论  71-75
小结  75-76
参考文献  76-84
附录  84-85
致谢  85

中华绒螯蟹Δ6与Δ9去饱和酶在脂肪酸合成过程中的作用初探及延伸因子EF-1δ和EF-2的初步研究

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