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新西兰兔IL-1B和TNF基因多态性与非特异性消化道紊乱的关联分析

作　者: 彭瑾
导　师: 赖松家
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 新西兰兔 IL-1B TNF 非特异性消化道紊乱
分类号: S858.291
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

非特异性消化道紊乱是家兔养殖中遇到的重要疾病,其病因未明,因此没有特效的药物治疗和预防手段。现代生物技术的发展为探索其发病机理及其防治提供了新途径。IL-1β和TNF是重要的促炎细胞因子,在诱导和调节炎症反应中发挥着关键的生物学作用。本试验首先通过对IL-1B和TNF基因全部外显子序列进行直接测序寻找SNPs位点,随后采用HRM技术对候选SNPs位点进行基因分型。应用Case-Control研究方法对IL-1B和TNF基因SNPs位点与非特异性消化道紊乱进行关联分析；采用低纤维饲料诱导新西兰兔非特异性消化道紊乱的发生,测定结肠、回肠和圆小囊三个组织中IL-1B和TNF基因1mRNA相对表达量,分析不同严重程度组、不同基因型以及不同组织mRNA相对表达量的关联性；最后对TNF基因候选SNP位点与日龄体重进行关联分析。试验结果如下：(1)IL-1B基因外显子4存在2个SNPs位点,分别为c.202G>A和c.223C＞A;TNF基因共有8个SNPs位点,其中2个SNPs位点位于外显子1(c.56A>G和c.87C>T),3个SNPs位点位于内含子1,3个SNPs位点位于内含子2。根据SMART、 SignalIP4.1和PANTHER在线软件以及△RSCU值分析,最终选择IL-1B c.202G>A位点和TNF c.56A>G、c.87C>T位点进行后续试验。(2) IL-1B c.202G>A位点A等位基因(OR=4.817,P=0.022)和GA基因型(OR=5.000,P=0.020)能增加新西兰兔患非特异性消化道紊乱的风险；TNF c.56A>G位点G等位基因(OR=2.208,P=0.018)、c.87C>T位点C等位基因(OR=2.005,P=0.0001)和c.87C>T位点CC基因型(OR=2.823,P=0.002)能增加新西兰兔患非特异性消化道紊乱的风险；TNF单倍型H1(AT)和单倍型组合H1H1(ATAT)能降低新西兰兔患非特异性消化道紊乱的风险。(3)随着非特异性消化道紊乱严重程度的加重,IL-1B和TNF基因mRNA相对表达量在三个组织中都呈现上升趋势,且在结肠中,严重组与健康组之间的差异达到显著水平(P<0.05),表明IL-1B和TNF基因mRNA目对表达量与非特异性消化道紊乱的严重程度密切相关。(4)在三个组织中,IL-1B c.202G>A位点不同基因型IL-1B mRNA相对表达量之间的差异未达到显著水平(P>0.05),表明IL-1B c.202G>A位点多态性与IL-1BmRNA相对表达量无显著相关；TNFc.56A＞G位点AG基因型TNF mRNA相对表达量在结肠和回肠中高于AA基因型,且在回肠中达到极显著水平(P=0.003); TNF c.87C>T位点不同基因型TNF mRNA相对表达量之间的差异在三个组织中都未达到显著水平(P>0.05)；而TNF H2H4(ACGC)单倍型组合TNF mRNA相对表达量在结肠和回肠中最高,且显著高于其余3种单倍型组合(P<0.05),表明在TNF c.56A＞G位点和c.87C>T位点的共同作用下,其单倍型组合与TNFmRNA相对表达量相关。(5)圆小囊IL-1B和TNF基因mRNA相对表达量极显著高于结肠和回肠(P<0.01),结肠最低,且结肠与回肠之间的差异不显著(P>0.05),表明IL-1B和TNF基因mRNA相对表达量在三个组织之间存在差异。同时,相关性分析表明IL-1B与TNF基因mRNA相对表达量之间呈正相关(r>0,P<0.05)。(6) TNF c.87C＞T位点不同基因型各日龄体重之间的差异未达到显著水平(P>0.05),表明TNF c.87C＞T位点不同基因型与各日龄体重无显著相关。本研究表明IL-IB c.202G>A和TNF c.56A＞G、c.87C＞T位点可以作为与非特异性消化道紊乱相关的重要候选遗传位点。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
1. 文献综述  12-19
  1.1 家兔消化道紊乱研究进展  12-14
    1.1.1 病原性因素  13
    1.1.2 非病原性因素  13-14
  1.2 IL-1β研究进展  14-16
    1.2.1 IL-1β结构及生物学功能  15-16
    1.2.2 IL-1B基因SNPs位点与疾病易感性的研究  16
  1.3 TNF研究进展  16-18
    1.3.1 TNF结构及生物学功能  16-17
    1.3.2 TNF基因SNPs位点与疾病易感性的研究  17-18
  1.4 试验目的、意义及主要内容  18-19
    1.4.1 试验目的与意义  18
    1.4.2 试验主要内容  18-19
2. 试验材料与方法  19-32
  2.1 试验材料  19-22
    2.1.1 试验动物与样本采集  19-20
    2.1.2 主要仪器设备  20-21
    2.1.3 试验主要试剂及配置  21-22
  2.2 试验方法  22-32
    2.2.1 全基因组DNA提取  22-23
    2.2.2 全基因组DNA检测  23
    2.2.3 组织总RNA的提取  23-24
    2.2.4 组织总RNA检测  24-25
    2.2.5 cDNA的合成  25-26
    2.2.6 目的基因扩增  26-28
    2.2.7 HRM分型  28-29
    2.2.8 实时荧光定量PCR  29-31
    2.2.9 数据分析  31-32
3. 结果与分析  32-49
  3.1 IL-1B和TNF基因SNPs筛选  32-36
    3.1.1 全基因组DNA和组织总RNA提取结果  32-33
    3.1.2 PCR扩增结果  33-34
    3.1.3 SNPs筛选  34-35
    3.1.4 SNPs功能预测分析  35-36
  3.2 IL-1B和TNF基因与NSDD的关联分析  36-40
    3.2.1 HRM分型结果  36-38
    3.2.2 IL-1B和TNF基因与NSDD的关联分析  38-40
  3.3 IL-1B和TNF基因mRNA相对表达量分析  40-48
    3.3.1 标准曲线的绘制  40-41
    3.3.2 实时荧光定量PCR结果  41-42
    3.3.3 IL-1B和TNF基因mRNA相对表达量  42-48
  3.4 TNFc.87 C>T位点基因型与日龄体重的关联分析  48-49
4. 讨论  49-55
  4.1 IL-1B和TNF基因SNPs位点分析  49-50
  4.2 HRM分型  50
  4.3 Case-Control研究方法  50-51
  4.4 IL-1B和TNF基因与NSDD的关联分析  51-52
    4.4.1 IL-1B基因与NSDD的关联分析  51
    4.4.2 TNF基因与NSDD的关联分析  51-52
  4.5 IL-1B和TNF基因mRNA相对表达量分析  52-54
    4.5.1 不同严重程度组mRNA相对表达量分析  52-53
    4.5.2 不同基因型mRNA相对表达量分析  53-54
    4.5.3 不同组织mRNA相对表达量分析  54
  4.6 TNF基因与日龄体重的关联分析  54-55
5. 结论  55-56
参考文献  56-62
致谢  62-64
攻读学位期间发表的学术论文  64

新西兰兔IL-1B和TNF基因多态性与非特异性消化道紊乱的关联分析

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