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辽宁新品系绒山羊新基因GMPR2生物学功能研究及K26抗体制备

作　者: 曲杨乐
导　师: 金梅
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 动物学
关键词: 辽宁新品系绒山羊 GMPR2基因功能褪黑激素 K26抗体
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

辽宁新品系绒山羊是我国特有的遗传资源，其山羊绒有着十分重要的经济价值。因此研究辽宁新品系绒山羊与经济性状相关基因的功能就显得尤为重要。本文旨在研究辽宁新品系绒山羊GMPR2新基因在皮肤中的功能及与绒毛生长的关系。首先对该基因进行了生物信息学分析，再利用地高辛标记的原位杂交技术对其进行定位研究，然后利用荧光定量技术对其进行相对定量分析，RT-PCR技术检测GMPR2基因是否在其它器官中表达，最后验证不同浓度、不同时间褪黑激素处理是否影响该基因的表达。实验证明：GMPR2可能间接调节初次级毛囊的生长萎缩。另外，因辽宁新品系绒山羊绒毛纤维的形成主要与微丝角蛋白（KIFs，K）的表达有关，为研究K26基因表达蛋白的表达量和表达位置，本实验构建BL21-pET32a-K26表达载体，提取重组蛋白后将其免疫到新西兰雄兔中，制作兔抗K26基因抗体，为后续研究工作奠定基础。重要结果如下：（1）经ORF Finder与Blast比对，确定得到的基因全长为GMPR2基因，其与牛GMPR2同源性最高。结构域分析显示，辽宁新品系绒山羊GMPR2含有一个与IMPDH相似的TIM管结构保守位点，该位点具有氧化还原活性，属于IMPDH/GMPR酶家族。（2）基因定位分析显示GMPR2基因在初、次级毛囊中都有表达，表达部位为初、次级毛囊的内根鞘。（3）基因定量分析显示GMPR2基因在退行期初级毛囊中的表达量约为次级毛囊的5.45倍，差异显著（P<0.01），在兴盛期与休止期表达量相差不明显；（4）另外，GMPR2基因只在皮肤中表达，在心、肝、肾、肺、脾内脏器官中未发现该基因表达；（5）用不同浓度（0.02g/L、0.2g/L、1g/L）、不同时间（24h、48h、72h）的褪黑激素处理辽宁新品系绒山羊兴盛期培养的皮肤细胞后，GMPR2基因的表达量都有明显的降低。其中，褪黑激素浓度为0.2g/L，处理48h，GMPR2基因的表达量降低最为明显(P<0.01)。（6）通过ELISA方法和Westen blot方法对抗体进行效价分析和特异性鉴定，结果表明效价达到1：32万以上，且特异性较好，说明制备的抗K26多克隆抗体成功。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
引言  11-12
1 综述  12-19
  1.1 辽宁新品系绒山羊  12
  1.2 毛囊结构  12-13
  1.3 毛囊生长变化  13-14
  1.4 GMPR2 研究进展  14-15
  1.5 褪黑激素  15-17
  1.6 角蛋白综述  17-19
    1.6.1 角蛋白结构  17
    1.6.2 角蛋白家族组成  17-18
    1.6.3 角蛋白家族研究进展  18-19
2 GMPR2 基因序列分析  19-28
  2.1 GMPR2 的生物信息学分析  19-27
  2.2 讨论  27-28
3 原位杂交  28-36
  3.1 实验样本  28
  3.2 实验试剂及仪器  28-29
  3.3 实验方法  29-32
  3.4 实验结果  32-34
  3.5 讨论  34-36
    3.5.1 实验结果讨论  34
    3.5.2 实验注意事项  34-36
4 实时定量 PCR  36-41
  4.1 实验材料  36
  4.2 实验试剂及仪器  36
  4.3 实验方法  36-38
    4.3.1 分离初次级毛囊  36
    4.3.2 初次级毛囊的总 RNA 提取  36
    4.3.3 反转录反应  36
    4.3.4 Real Time PCR  36-38
  4.4 实验结果  38-40
    4.4.1 RNA 提取  38-39
    4.4.2 实时荧光定量  39-40
  4.5 讨论  40-41
    4.5.1 实验结果讨论  40
    4.5.2 实验注意事项  40-41
5 RT-PCR  41-46
  5.1 实验材料  41
    5.1.1 实验样本  41
    5.1.2 实验试剂及仪器  41
  5.2 实验方法  41-43
    5.2.1 皮肤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏总 RNA 的提取  41
    5.2.2 反转录反应  41-42
    5.2.3 PCR 反应  42-43
  5.3 实验结果  43-45
    5.3.1 RNA 提取  43-44
    5.3.2 RT-PCR  44-45
  5.4 讨论  45-46
    5.4.1 结果讨论  45
    5.4.2 注意事项  45-46
6 褪黑激素处理  46-51
  6.1 实验材料  46-47
    6.1.1 实验样本  46
    6.1.2 实验试剂及仪器  46-47
  6.2 实验方法  47-48
    6.2.1 取材  47
    6.2.2 原代培养  47
    6.2.3 传代培养  47-48
    6.2.4 退黑激素作用于羊耳成纤维细胞  48
    6.2.5 细胞中总 RNA 的提取  48
    6.2.6 反转录成 cDNA  48
    6.2.7 Real Time PCR  48
  6.3 实验结果  48-49
    6.3.1 RNA 提取  48-49
    6.3.2 实时定量 PCR  49
  6.4 讨论  49-51
    6.4.1 结果讨论  49-50
    6.4.2 实验注意事项  50-51
7 K26 抗体制备  51-78
  7.1 实验材料  51-55
    7.1.1 实验样本  51
    7.1.2 实验器材  51
    7.1.3 实验耗材  51-52
    7.1.4 试剂配方  52-55
  7.2 实验方法  55-66
    7.2.1 信息学分析  55
    7.2.2 提取 RNA  55
    7.2.3 反转录为 cDNA  55
    7.2.4 PCR 反应  55-56
    7.2.5 产物纯化  56-57
    7.2.6 连接反应  57
    7.2.7 转化反应  57-58
    7.2.8 筛选后 PCR  58
    7.2.9 提取质粒  58-59
    7.2.10 酶切反应  59-60
    7.2.11 连接反应  60
    7.2.12 转化反应  60
    7.2.13 诱导条件  60-61
    7.2.14 SDS-PAGE 电泳  61-62
    7.2.15 重组蛋白可溶性检测  62
    7.2.16 大量诱导  62
    7.2.17 重组蛋白纯化  62-63
    7.2.18 透析  63-64
    7.2.19 免疫动物  64
    7.2.20 抗血清效价检测  64-65
    7.2.21 提纯抗体  65
    7.2.22 抗体效价检测  65
    7.2.23 抗体特异性检测  65-66
  7.3 实验结果  66-76
    7.3.1 信息学分析结果  66-68
    7.3.2 提取 RNA  68-69
    7.3.3 PCR 反应  69-70
    7.3.4 K26 菌落 PCR  70
    7.3.5 K26 表达载体  70-71
    7.3.6 K26 蛋白原核表达  71-72
    7.3.7 可溶性检测  72-73
    7.3.8 蛋白纯化  73-74
    7.3.9 抗血清效价检测  74-76
    7.3.10 兔抗 K26 抗体特异性  76
  7.4 讨论  76-78
    7.4.1 原核表达载体系统  76-77
    7.4.2 选择目的基因片段  77
    7.4.3 多克隆抗体的制备  77-78
结论  78-79
参考文献  79-84
附录 A 原位杂交相关试剂配方  84-86
附录 B 不同时期 Actin、GMPR2 基因的扩增曲线和融解曲线图  86-90
附录 C 不同时间、不同浓度褪黑激素处理 Actin 基因、GMPR2 基因的扩增曲线和融解曲线图  90-95
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  95-96
致谢  96

辽宁新品系绒山羊新基因GMPR2生物学功能研究及K26抗体制备

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