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匀浆提取银中杨酚苷及其体外抗PRV活性与清除DPPH自由基能力的研究

作　者: 于雪莹
导　师: 祖元刚
学　校: 东北林业大学
专　业: 植物学
关键词: 银中杨酚苷匀浆提取猪伪狂犬病病毒 PRV 1,1-二苯基-2-苦基胼自由基 DPPH·
分类号: S855.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文在建立总酚苷可见分光光度法检测方法和水杨苷含量高效液相色谱法的检测方法的基础上,进行银中杨中酚苷匀浆提取工艺的影响因素试验研究。在单因素试验的基础上,应用响应面法优化工艺,得到最佳工艺和银中杨酚苷提取物,并研究了银中杨酚苷提取物大孔吸附树脂纯化的方法。在对猪伪狂犬病病毒(SC毒株)的分离及鉴定的基础上,完成银中杨酚苷体外抗伪狂犬病病毒(PRV)的活性试验,并进行了银中杨酚苷与PRV相互作用荧光定量PCR检测。同时,通过清除DPPH能力测试方法考查了银中杨酚苷的抗氧化能力。具体研究结果如下：1、采用响应面法对匀浆提取银中杨干树皮、新鲜树皮、新鲜芽鳞、鲜叶、新鲜芽鳞和枝叶混合物(W芽鳞：W枝叶=1：1)五种原料中总酚苷、水杨苷成分进行优化。考察了匀浆时间、乙醇体积分数、匀浆次数、料液比、粒径大小等因素对提取工艺的影响,应用了Box-Behnken的实验设计,选取总酚苷、水杨苷纯度与得率作为响应值。响应面法优化后提取工艺条件为：银中杨干树皮酚苷提取条件：提取时间5min、乙醇体积分数10%、液料比10：1mL/g、提取次数1次。在所确定的工艺条件下,酚苷纯度3.654%；水杨苷纯度0.3726%；得率6.5571%；银中杨新鲜树皮酚苷提取条件：提取时间5min、乙醇体积分数15%、液料比5：1mL/g、提取次数1次。在所确定的工艺条件下,酚苷纯度2.4289%;水杨苷纯度0.3099%；得率2.5786%；银中杨新鲜芽鳞酚苷提取条件：提取时间3mmin、乙醇体积分数10%、液料比15：1mL/g、提取次数1次。在所确定的工艺条件下,酚苷纯度2.0615%；水杨苷纯度0.7396%；得率4.877%；银中杨鲜叶酚苷提取条件：提取时间3mmin、乙醇体积分数15%、液料比10：1mL/g、提取次数1次。在所确定的工艺条件下,酚苷纯度5.554%；水杨苷纯度0.5049%；得率4.4156%；银中杨新鲜芽鳞和枝叶混合物酚苷提取条件：提取时间5min、乙醇体积分数20%、液料比10：1mL/g、提取次数1次。在所确定的工艺条件下,酚苷纯度4.2021%；水杨苷纯度1.0679%；得率4.8915%。经过HPD-700大孔树脂吸附实验,酚苷、水杨苷含量分别从44.0561%和4.0616%提高到86.4466%和9.1899%,回收率80.2341%。2、银中杨酚苷体外具有抗PRV感染细胞的能力,通过观察细胞病变效应(CPE),在同等条件下,鲜树皮酚苷提取物体外抗PRV效果最好,其次为干树皮酚苷提取物,都优于利巴韦林和水杨苷。对107TCIDso PRV,半数有效抑制浓度分别为：干树皮酚苷提取物IC50577.981ug/ml、鲜树皮酚苷提取物IC50561.35ug/ml。根据PRV-SC毒株的gE基因参考序列,建立PRV荧光定量PCR方法：构建阳性标准品(PRV-gE质粒),进行PCR鉴定。经序列测定,测定结果与参考毒株的基因序列完全一致。建立荧光定量PCR标准曲线,进行敏感性试验和特异性试验：得到标准曲线方程为Y=3.489*LOG(X)+46.81,相关系数R2=0.999,扩增效率E=0.935。对银中杨酚苷与PRV相互作用后,PRV载量进行定量分析。定量PCR拷贝数与CPE结果相符,PRV载量有明显的变化。3、对DPPH的清除能力以半清除率浓度ICs0表示,各抗氧化剂的抗氧化能力的大小顺序为银中杨新鲜枝叶芽鳞混合物酚苷>银中杨新鲜鳞芽酚苷>VC>银中杨鲜叶酚苷>银中杨鲜皮酚苷>银中杨干皮酚苷>BHT。ICso值分别为0.3519mg/mL、0.3553mg/mL、0.3742mg/mL、0.3810mg/mL、0.4492mg/mL、0.5288mg/mL、0.6277mg/mL。银中杨清除DPPH·的能力与酚苷含量成正相关,银中杨新鲜枝叶芽鳞混合物酚苷、银中杨新鲜鳞芽酚苷清除DPPH·的能力均强VC,各酚苷清除DPPH·的能力均优于BHT,其中银中杨新鲜枝叶芽鳞混合物的酚苷提取物清除DPPH·的能力最强。本研究的主要创新性表现在三个方面：首次应用匀浆提取的方法从银中杨中提取酚苷；首次验证银中杨酚苷具有体外抗PRV病毒活性作用；首次验证银中杨酚苷提取物具有清除DPPH自由基的能力,新鲜原料提取物的这种能力体现更为明显。本研究的目的意义在于在自主创新的生态工艺理论体系指导下,使用匀浆提取的生态分离方法完成银中杨酚苷的提取分离,得到银中杨酚苷提取物,对银中杨的资源实现最大化的利用,最终以尽可能少的资源消耗和尽可能小的环境代价实现最大的经济效益和生态效益。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-12
1 绪论  12-27
  1.1 引言  12
  1.2 杨树酚苷成分的研究概述  12-17
  1.3 杨树酚苷活性的研究概述  17-19
  1.4 抗PRV活性研究概述  19-21
  1.5 DPPH·自由基清除作用概述  21-23
  1.6 匀浆提取的研究概述  23-24
  1.7 本研究目的和内容以及主要创新点  24-27
    1.7.1 本研究目的和主要内容  24-26
    1.7.2 本研究主要创新点  26-27
2 银中杨酚苷匀浆提取工艺的研究  27-98
  2.1 引言  27
  2.2 仪器与材料  27-28
    2.2.1 实验仪器  27
    2.2.2 实验材料和试剂  27-28
  2.3 实验方法  28-34
    2.3.1 总酚苷可见分光光度法检测  28
    2.3.2 水杨苷含量高效液相色谱法检测  28-29
    2.3.3 银中杨干树皮中酚苷匀浆提取工艺的影响因素试验  29-31
    2.3.4 银中杨新鲜树皮、新鲜芽鳞、鲜叶和新鲜芽鳞枝叶混合物中酚苷匀浆提取工艺的影响因素试验  31-32
    2.3.5 银中杨酚苷大孔吸附树脂纯化工艺方法  32-34
  2.4 结果与讨论  34-96
    2.4.1 可见分光光度法检测总酚苷的方法学考察  34-36
    2.4.2 高效液相色谱法检测水杨苷的方法学考查  36-39
    2.4.3 银中杨干树皮中酚苷匀浆提取工艺的研究  39-54
    2.4.4 银中杨中新鲜树皮、芽鳞和枝叶中酚苷匀浆提取工艺的研究  54-79
    2.4.5 银中杨酚苷的提取效率测定  79-83
    2.4.6 银中杨酚苷大孔吸附树脂纯化工艺的研究  83-96
  2.5 本章小结  96-98
3 银中杨酚苷体外抗伪狂犬病病毒(PRV)活性的研究  98-110
  3.1 引言  98
  3.2 材料和方法  98-102
    3.2.1 实验材料  98
    3.2.2 主要试剂和仪器  98
    3.2.3 猪伪狂犬病病毒(SC毒株)的分离及鉴定  98-100
    3.2.4 银中杨酚苷体外抗伪狂犬病病毒(PRV)活性研究方法  100
    3.2.5 银中杨酚苷与PRV相互作用荧光定量PCR检测方法  100-101
    3.2.6 数据处理  101-102
  3.3 结果与讨论  102-109
    3.3.1 猪伪狂犬病毒(SC毒株)的分离及鉴定  102-103
    3.3.2 银中杨酚苷体外抗猪伪狂犬病病毒PRV的活性  103-106
    3.3.3 银中杨酚苷与PRV相互作用荧光定量PCR检测  106-109
  3.4 本章小结  109-110
4 银中杨酚苷清除DPPH·自由基能力的研究  110-117
  4.1 引言  110
  4.2 材料和方法  110-111
    4.2.1 实验材料  110
    4.2.2 实验设备  110
    4.2.3 实验方法  110-111
  4.3 结果与讨论  111-116
  4.4 本章小结  116-117
结论  117-119
参考文献  119-130
附录  130-131
攻读学位期间发表的学术论文  131-132
致谢  132-133

匀浆提取银中杨酚苷及其体外抗PRV活性与清除DPPH自由基能力的研究

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