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银杏内生真菌抗氧化活性的初步研究

作　者: 高樱萍
导　师: 葛飞
学　校: 安徽工程大学
专　业: 微生物学
关键词: 银杏 内生真菌 球毛壳菌 抗氧化 培养条件 分离纯化
分类号: S792.95
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


植物内生真菌是一类生长在健康植物组织中的特殊真菌,其种类丰富、来源广泛,是新的天然活性产物的主要来源之一。目前已从各种植物中分离出多种具有生物活性的内生真菌,其次级代谢产物均具有不同的生物活性,如抗肿瘤活性、抗菌、植物生长调节剂类以及抗氧化活性等。植物内生真菌由于其特殊的生长环境,在医药开发、工农业生产及环境保护等领域具有广泛的应用前景。本论文从健康银杏组织中分离出32株内生真菌,利用DPPH抗氧化模型测定32株内生真菌的抗氧化活性,从中筛选出8株抗氧化活性较为稳定、抗氧化活性较高的菌株,并对其抗氧化活性进行复筛。复筛采用DPPH法对8株菌株菌丝体的抗氧化活性进行测定,为获得优良菌株提供进一步的参考。结果表明,菌株GCZX015具有较高的抗氧化活性,因此,对其进行进一步的研究。采用经典形态学和分子生物学相结合的方法对菌株GCZX015进行鉴定,结果表明,菌株GCZX015与球毛壳菌的rDNA序列具有较高的的同源性,达99%,且与球毛壳菌形态特征比较的结果一致,初步确定该菌株为球毛壳菌。采用单因素实验法确定了菌株GCZX015生长的最佳条件为：最适生长温度为25℃、转速170r/min、培养时间8d、接种量5%、装液量为100mL/250mL,生长的pH范围较宽,但在pH为6.5时产物活性最高。同时,考察了营养性因素对菌株GCZX015产物抗氧化活性的影响。根据Plackett-Burman实验结果确定了硫酸镁、马铃薯以及发酵液pH对菌株生长具有显著的影响。采用响应面优化法对马铃薯、硫酸镁以及培养基初始pH进行优化,得到三个条件的最佳组合：为马铃薯含量为209.5420g/L、硫酸镁浓度为0.0019mg/mL、pH为6.4132,在此条件下,自由基清除率理论值为96.51%。对菌株GCZX015的大规模发酵液通过离心、醇沉、冻干等处理,将冻干粉溶于甲醇,通过硅胶柱色谱对冻干粉甲醇溶液进行分离。柱层析分离得到的样品通过薄层层析进行合并,收集到6个样品,分别测定6个样品的抗氧化活性,其中2号样品的抗氧化活性最大为97.03%。在此基础上,利用制备型色谱对2号样品进行进一步的分离纯化,获得2-1组分,其抗氧化活性为97.37%。利用高效液相色谱和液-质联用仪进行定性分析,初步确定发酵液当中的抗氧化活性成分主要为槲皮素。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第1章 绪论  13-24
  1.1 植物内生真菌及其研究概述  13-17
    1.1.1 植物内生真菌简介  13
    1.1.2 植物内生真菌的基本特征及其多样性  13-14
    1.1.3 植物内生真菌的分布  14-15
    1.1.4 植物内生真菌的生物学作用  15-16
    1.1.5 植物内生真菌的鉴定  16-17
  1.2 银杏内生真菌研究概况  17-18
  1.3 球毛壳菌研究进展  18
  1.4 抗氧化活性研究进展  18-23
    1.4.1 氧自由基研究概况  18-21
    1.4.2 抗氧化活性的筛选方法  21
    1.4.3 天然抗氧化剂的研究进展  21-23
  1.5 本研究的内容和意义  23-24
第2章 银杏内生真菌的分离与抗氧化活性菌株的筛选  24-31
  2.1 材料与方法  24-26
    2.1.1 材料  24-25
    2.1.2 方法  25-26
  2.2 结果与分析  26-29
    2.2.1 32株银杏内生真菌发酵液甲醇提取物DPPH自由基清除率比较  26-28
    2.2.2 8株银杏内生真菌菌丝体不同溶剂提取物自由基清除率比较  28-29
  2.3 本章小结  29-31
第3章 银杏内生真菌GCZX015的鉴定  31-36
  3.1 材料和方法  31-33
    3.1.1 材料  31-32
    3.1.2 方法  32-33
  3.2 结果与分析  33-34
    3.2.1 菌株GCZX015的形态学鉴定  33-34
    3.2.2 菌株GCZX015分子生物学鉴定  34
  3.3 本章小结  34-36
第4章 银杏内生真菌GCZX015的发酵条件优化  36-54
  4.1 材料与方法  36-37
    4.1.1 材料  36-37
  4.2 方法  37-39
    4.2.1 非营养性因素的条件优化  37-38
    4.2.2 营养性因素条件的优化  38-39
  4.3 结果与分析  39-47
    4.3.1 非营养性因素的条件优化结果  39-44
    4.3.2 营养性因素的条件优化的结果  44-47
  4.4 响应面优化实验  47-52
    4.4.1 Plackett-Burman设计法筛选主要因素  47-49
    4.4.2 响应面优化实验  49-51
    4.4.3 响应面分析  51-52
  4.5 本章小结  52-54
第5章 银杏内生真菌GCZX015抗氧化活性产物的初步分离纯化  54-65
  5.1 材料和方法  54-59
    5.1.1 材料  54-55
    5.1.2 菌株GCZX015抗氧化活性成分的分离纯化  55-59
  5.2 结果与分析  59-64
    5.2.1 薄层层析结果  59-60
    5.2.3 硅胶柱层析结果  60-61
    5.2.4 活性组分的进一步分离纯化  61
    5.2.5 2-1组分的高效液相色谱分析结果  61-62
    5.2.6 2-1组分的液-质联用结果分析  62-64
  5.3 本章小结  64-65
第6章 结论与展望  65-68
  6.1 结论  65-67
  6.2 展望  67-68
参考文献  68-75
附录1 银杏内生真菌  75-79
附录2 槐树内生真菌及其自由基清除率  79-81
附录3 菌株GCZX015的18SrDNA序列  81-82
附录4 菌株GCZX015与OUCMBI101038的ITS序列相似性比较  82-83
研究生在读期间发表的论文情况  83-84
致谢  84

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶乔木 > 银杏
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