学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

文心兰ACC合成酶基因的克隆及其表达分析

作　者: 石乐松
导　师: 刘进平
学　校: 海南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 文心兰 ACC合成酶基因乙烯 RACE Real-time PCR 基因表达
分类号: S682.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
下　载: 2次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

热带兰花生产是高科技农业重要组成部分,是当今国内外最具活力的产业之一。文心兰(Oncidium)是兰科文心兰属植物总称。文心兰作为重要的热带兰花种类,在热带兰花产业中占有重要的比重。兰科植物花朵的衰老过程为典型的呼吸跃变型,乙烯是主要的调控因子。在高等植物乙烯生物合成过程中,ACC合成酶是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转化为ACC这一个过程中的关键酶,是乙烯合成途径的限速酶。在分子水平研究改变文心兰切花的衰老时间,对目前热带兰花产业具有重要的意义。本研究选用从切花主栽品种O. Gower Ramsey选育出的“黄金2号’’(Oncidium Golden NO.2)(由台湾省大地兰园选育)作为实验材料,利用RACE技术克隆了ACC合成酶基因OnACS2(GeneBank登录号：KJ004563) cDNA全长。并对其进行了序列的生物信息学分析、表达特征分析及功能鉴定,获得如下结果：1.采取CTAB-LiCl法提取文心兰不同组织器官的总RNA,经电泳检测分析,条带单一符合后面的分子克隆实验要求。根据ACC合成酶基因的保守区域设计引物,PCR扩增获得了OnACS2基因的中间片段,利用RACE技术克隆到OnACS2基因的3’端和5’端序列,获得一条长度为1557bp大小的OnACS2基因cDNA全长序列,编码435个氨基酸残基、分子大小为49.1kDa、pI为7.51的蛋白；使用特异引物对OnACS2基因组进行LA-PCR扩增,得到的片段经序列比对,发现OnACS2基因包含有3个内含子、4个外显子；OnACS2氨基酸序列经比对发现,具有ACS基因家族共有的特性,氨基酸序列具有7个保守区域、11个保守碱基和丝氨酸活性中心。2.原核表达分析,成功构建了原核表达载体pET-OnACS2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析得到了一条大小与预测相近的蛋白条带：进一步研究ACC合成酶的特性,从含有pET-OnACS2的工程菌液中提取ACS蛋白,通过酶促反应测定其生物活性,检测结果表明在大肠杆菌中表达的ACS蛋白与自然状态的ACS蛋白生物活性相似。3.分析OnACS2在文心兰不同组织器官中的表达情况,经Real-time PCR分析得出,OnACS2基因在文心兰的花蕊柱组织中的表达量最高,花瓣、花萼、唇瓣等其它组织中OnACS2基因有少量的表达。4.分析文心兰花朵衰老过程中OnACS2基因的表达特征、乙烯释放规律,确定花朵衰老、OnACS2基因的表达和乙烯释放规律三者之间的关联。结果表明,组织中OnACS2基因mRNA的积累会导致乙烯释放速率的加速。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-20
  1.1 文心兰简介  9-11
    1.1.1 文心兰在分子生物学上的研究进展  10-11
    1.1.2 文心兰切花衰老研究概况  11
  1.2 植物切花衰老分子机制的研究进展  11-16
    1.2.1 乙烯的概述  11-12
    1.2.2 乙烯合成途径及其与切花衰老的关系  12-14
    1.2.3 分子水平调控乙烯合成  14-16
  1.3 RACE技术的应用  16-18
    1.3.1 获取全长cDNA  16-17
    1.3.2 RACE原理  17
    1.3.3 RACE技术在植物基因工程上的应用  17-18
  1.4 研究内容及其目的意义  18-19
  1.5 技术路线  19-20
2 实验材料与方法  20-39
  2.1 实验材料与试剂  20-21
    2.1.1 植物材料  20
    2.1.2 菌种与载体  20
    2.1.3 生化试剂和试剂盒  20
    2.1.4 主要仪器和设备  20-21
  2.2 实验方法与步骤  21-39
    2.2.1 CTAB-LiCl法提取文心兰总RNA  21-22
    2.2.2 cDNA的合成  22
    2.2.3 文心兰ACC合成酶基因中间片段的分离  22-24
    2.2.4 文心兰ACC合成酶基因3’末端序列克隆  24-26
    2.2.5 文心兰ACC合成酶基因5’末端序列克隆  26-29
    2.2.6 文心兰ACC合成酶基因cDNA全长的扩增  29-30
    2.2.7 OnACS2全长基因组序列的获得  30-31
    2.2.8 OnACS2基因全长的信息学分析  31
    2.2.9 OnACS2基因的原核表达  31-35
    2.2.10 不同花期不同花器官乙烯释速率的测定  35-36
    2.2.11 文心兰切花衰老过程中OnACS2基因的表达分析  36-39
3 结果与分析  39-60
  3.1 总RNA提取结果  39
  3.2 文心兰ACC合成酶基因OnACS2的分离  39-43
    3.2.1 OnACS2基因中间片段的获得  39-41
    3.2.2 OnACS2基因3’端的扩增  41
    3.2.3 OnACS2基因5’端序列的克隆  41-42
    3.2.4 OnACS2基因全长序列的扩增  42-43
  3.3 文心兰OnACS2基因的生物信息学分析  43-49
    3.3.1 OnACS2基因的序列分析  43-46
    3.3.2 OnACS2基因推导蛋白结构分析  46-48
    3.3.3 ACS基因进化树的分析  48-49
  3.4 文心兰OnACS2基因的原核表达  49-53
    3.4.1 原核表达产物分析  50-51
    3.4.2 ACC合成酶活性的测定  51-53
  3.5 文心兰OnACS2基因的表达特征分析  53-60
    3.5.1 瓶插期间OnACS2在文心兰切花各器官中的乙烯释放状况  53-56
    3.5.2 相对荧光定量分析OnACS2基因的表达量  56-58
    3.5.3 花蕊柱中OnACS2基因的表达量与乙烯释放速率的关系  58-60
4 讨论  60-64
  4.1 OnACS2基因的特征分析  60-61
  4.2 OnACS2基因的原核表达  61
  4.3 OnACS2基因的特异性表达分析  61-64
    4.3.1 荧光定量PCR  61-62
    4.3.2 OnACS2基因在文心兰不同组织中的表达特征  62
    4.3.3 文心兰花器官衰老、乙烯释放和OnACS2基因表达三者的关联  62-64
5 结论  64-65
参考文献  65-71
附录  71-74
英文缩写词表(List of abbreviation)  74-75
致谢  75

文心兰ACC合成酶基因的克隆及其表达分析

内容摘要

全文目录

相似论文