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草莓G6PDHs的克隆及其表达模式研究

作　者: 于定群
导　师: 汤浩茹
学　校: 四川农业大学
专　业: 果树学
关键词: 草莓 低温 G6PDHs 基因克隆 表达分析
分类号: S668.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


草莓(Fragaria×ananassa)是蔷薇(?)(?)(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物,属于园艺学的浆果类果树。它不仅是一种经济价值高、营养价值丰富的水果,同时也是一种肉质果实以及蔷薇科基因组学研究的模式植物。本课题从草莓低温锻炼过程中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH, EC1.1.1.49)及抗氧化酶等其他生理生化指标的变化入手,克隆获得了G6PDH等参与冷响应的13个关键基因,并结合来自Genbank的4个基因,分析了这些基因在草莓低温逆境中的表达模式。主要研究内容和结果如下：1分别测定了低温锻炼过程中草莓G6PDH的活性及活性氧(reactive oxygen species, ROS)包括超氧根离子(O2·-)和过氧化氢(H2O2)、抗氧化酶系统包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX),以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)、可溶性糖等含量的动态变化。结果表明：低温逆境中G6PDH活性显著增加与SOD、POD和MDA和O2·-水平密切相关,表明草莓抗寒性的增强与体内G6PDH的代谢水平密切相关。一方面,G6PDH催化产生的NADPH通过激活NADPH氧化酶产生活性氧,发生氧化猝发；另一方面,它可能参与了SOD、POD、CAT和APX的激活,从而猝发了许多其他重要的酶反应,进一步增强了细胞膜的稳定性,提高了草莓耐寒性。结合前人的研究和我们的结果,我们提出G6PDH在增强植物抗寒性过程中的可能生理作用模型图。2草莓叶片等组织中往往富含多糖、蛋白质、色素和酚类等物质极易发生褐化效应,为了获得高质量的草莓组织总RNA用于后续冷响应相关基因的克隆及表达研究,通过7种总RNA提取方法对草莓叶片提取质量进行比较总结,建立了一种方便快捷的适用于草莓各种组织的高质量总RNA提取方法——3%CTAB3。3通过类似电子克隆的方式获得了草莓低温逆境中G6PDH等参与冷响应的13个关键基因,包括3个G6PDH基因(FaG6PDH-Cy, Accession No. KC433888; FaG6PDH-P1、Accession No. KC433889; FaG6PDH-P2, Accession No. JQ260862.1)、4个SOD基因(FaCu/Zn SOD, Accession No. KC433884; FaFe SOD,, Accession No. KC433886; FaFe SOD2, Accession No. KC433887; FaMn SOD, Accession No. KC433893)、2个APX基因(FamAPX, Accession No. KC433892; FapAPX, AccessionNo.KC433895)、1个CAT基因(FaCAT, Accession No. KC433883)、2个谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)基因(FaGPX2, Accession No. KC433890; Fa GPX6, Accession No. KC433891)、1个NADPH氧化酶基因(FaNADPH, Accession No. KC433894)。4通过生物信息学的方法对草莓三种类型G6PDH的蛋白的物理化学性质、氨基酸序列、系统发育树分析以及蛋白质3级结构进行了分析。结果表明：草莓与野草莓的G6PDH的同源性在99%以上,与拟南芥、马铃薯、小麦、水稻的G6PDH的同源性也在80%以上,三者均是易溶、亲水性强的蛋白,并且在FaG6PDH-P1、 FaG6PDH-P2的N端均发现一段60个氨基酸左右的信号肽序列。进行系统发育树分析,发现FaG6PDH-Cy、FaG6PDH-P1、FaG6PDH-P2首先分别和各自类型的G6PDH家族聚在一起,然后各自与葡萄、蓖麻、甜杨、拟南芥等双子叶植物聚在一起。并且系统进化树中各物种间进化地位与其生物学分类地位一致。三种类型蛋白质的氢键α螺旋、β折叠、γ转角个数不同,但均含有NADP结合区和G6P结合区两个保守功能域。5采用实时定量PCR技术对克隆的G6PDH等参与冷响应的13个关键基因以及来自Genbank的4个关键基因FacAPX Accession No. AF159630.1、脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbate reductase, DHAR)基因FaDHAR2Accession No. HM045477,单脱氢抗坏血酸还原酶(Monodchydroascorbate reductase, MDAR)基因FaMDAR Accession No. JQ320104.1、谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase, GR)基因FaGR Accession No. JQ339738在低温逆境中的表达模式进行分析。结果表明：尽管G6PDHs、 NADPH以及各种抗性酶基因在低温锻炼中适应情况不同,但根据其表达趋势,低温锻炼中的植物可以大致分为两个阶段,即前期的应急反应阶段、后期的增强耐受能力阶段。在应急反应阶段,基因表达量逐渐增加,在后期的增强耐受能力阶段,随着氧化猝发、细胞膜结构的破坏,细胞受到毒害加剧,有的基因表达量有所降低,但随着植物逐渐适应低温逆境后基因表达量再次回升。有的基因如FaG6PDH-P1、FaMDAR以及FaGPX6对低温的抵抗性强,在整个低温逆境过程中表达量持续增加。比较特殊的是FaCAT,其在正常生长的植株中高度表达；但在低温中的表达量下降。植物可以通过低温锻炼后获得高水平表达的基因,这可能是植物经过低温逆境后抗寒性增强的主要原因。6结合各种酶在低温逆境中的生理响应以及冷响应相关基因的表达情况,分析得出冷响应相关基因的表达量和酶活力均在低温锻炼或脱锻炼过程中显著增加,从而促使草莓细胞膜的稳定性及抗寒性的提高。并且绝大多数冷响应基因在脱锻炼后仍维持较高水平的基因表达量和酶活力,得出在植物幼苗期通过低温锻炼的方式使植物获得抗寒能力的提高是一种简单而高效的方式。

全文目录


摘要  8-11
Abstract  11-14
缩略词  14-15
第一章 课题提出与前人研究进展  15-28
  1 引言  15
  2 国内外关于该课题的研究现状和发展趋势  15-28
    2.1 G6PDH的生物学特性研究  15-16
      2.1.1 植物G6PDH同功酶类  15-16
      2.1.2 植物G6PDH的调控  16
    2.2 G6PDH与植物生长发育及各种环境胁迫的关系  16-19
      2.2.1 G6PDH与植物生长发育  17
      2.2.2 G6PDH参与植物生物胁迫的应答  17-18
      2.2.3 G6PDH参与植物生物胁迫的应答  18-19
    2.3 植物G6PDH基因的克隆及表达  19-20
    2.4 植物G6PDH的缺失和替代  20-21
    2.5 已报道的植物G6PDH的关系  21-25
    2.6 立题依据及技术路线  25-28
      2.6.1 课题的目的与意义  25-26
      2.6.2 技术路线  26-28
第二章 草莓G6PDH在低温锻炼中的生理响应  28-40
  1 材料与方法  29-30
    1.1 材料及处理  29
    1.2 方法  29-30
      1.2.1 G6PDH的提取与活性测定  29
      1.2.2 ROS的测定  29
      1.2.3 SOD、CAT、POD和APX的提取与活性测定  29-30
      1.2.4 MDA及可溶性糖含量的测定  30
      1.2.5 数据分析  30
  2 结果与分析  30-36
    2.1 低温锻炼中G6PDH活性的变化  30-31
    2.2 低温锻炼中ROS的变化及与G6PDH的相关性分析  31-32
    2.3 低温锻炼中抗氧化酶活性变化及与G6PDH的相关性分析  32-34
    2.4 MDA、可溶性糖含量的变化及与G6PDH的相关性分析  34-36
  3 讨论与结论  36-40
    3.1 低温锻炼对G6PDH活性的影响  36
    3.2 低温锻炼中G6PDH与ROS的关系  36-37
    3.3 低温锻炼中G6PDH与MDA的关系  37
    3.4 低温锻炼中G6PDH与可溶性糖的关系  37-38
    3.5 低温锻炼中G6PDH与抗氧化酶的关系  38
    3.6 G6PDH在低温逆境中的生理作用  38-40
第三章 草莓总RNA提取方法的研究  40-49
  1 材料与方法  40-43
    1.1 试验材料  40-41
    1.2 试验方法  41-42
      1.2.1 基本操作步骤  41
      1.2.2 不同方法的操作步骤  41-42
    1.3 RNA完整性及质量检测  42
      1.3.1 RNA电泳分析  42
      1.3.2 RNA纯度检测  42
    1.4 RT-PCR检测  42-43
  2 结果与分析  43-47
    2.1 RNA完整性分析  43-44
    2.2 RNA纯度检测  44-46
    2.3 RT-PCR及序列分析  46-47
  3 讨论  47-49
第四章 草莓G6PDHs的克隆及其序列分析  49-63
  1 材料与方法  49-54
    1.1 试验材料  49
    1.2 工程菌株  49
    1.3 载体  49-50
    1.4 试验方法  50-54
      1.4.1 引物设计及合成  50-51
      1.4.2 cDNA第一链合成  51
      1.4.3 PCR扩增反应体系及程序  51-52
      1.4.4 PCR产物回收  52
      1.4.5 感受态细胞制备  52-53
      1.4.6 产物与载体的连接及转化  53
      1.4.7 重组质粒鉴定  53-54
    1.5 数据处理  54
      1.5.1 核酸序列分析  54
  2 结果与分析  54-62
    2.1 三种类型G6PDH基因的分离与克隆  54-55
    2.2 三种类型G6PDH序列的测定与分析  55-57
    2.3 三种类型G6PDH结构分析  57-58
    2.4 G6PDH系统发育分析  58-60
    2.5 G6PDH三级结构预测  60-62
  3 讨论  62-63
第五章 草莓G6PDHs及冷响应基因的表达模式研究  63-84
  1 材料与方法  64-69
    1.1 试验材料及处理  64-65
    1.2 试验方法  65-68
      1.2.1 相关基因的搜索与克隆  65-66
      1.2.2 定量引物设计及合成  66-67
      1.2.3 cDNA第一链合成  67-68
      1.2.4 实时定量PCR程序及体系  68
    1.3 数据处理  68-69
      1.3.1 核酸序列分析  68
      1.3.2 定量数据分析  68-69
  2 结果与分析  69-79
    2.1 相关基因的克隆  69
    2.2 基因表达模式分析  69-79
      2.2.1 标准曲线的构建  69-70
      2.2.2 G6PDH基因在草莓各组织及果实不同发育阶段表达模式  70-72
      2.2.3 G6PDH基因在草莓低温锻炼过程中的表达模式  72-73
      2.2.4 冷响应基因在草莓低温锻炼过程中的表达模式  73-79
  3 讨论  79-84
    3.1 G6PDH基因在草莓各组织及果实不同发育阶段表达模式  79-80
    3.2 G6PDH基因在草莓低温锻炼中的表达模式  80
    3.3 冷响应基因在草莓低温锻炼中的表达模式  80-82
    3.4 小结  82-84
第六章 需进一步研究的内容  84-86
参考文献  86-94
致谢  94-95
学习期间发表论文情况  95

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类 > 草莓
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