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转化山葡萄ICE基因培育抗寒葡萄新种质的研究

作　者: 袁红燕
导　师: 陶建敏
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: ‘1202’葡萄 ‘美人指’葡萄 ICE基因 农杆菌介导 抗寒鉴定 花粉管通道法
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 6次
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内容摘要


葡萄属于葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis. Linn.),是一种栽培价值很高的果树。然而葡萄冻害给生产带来很大损失,因此培育抗寒品种迫在眉睫。ICE基因能编码bHLH转录因子,其在低温诱导下能使一系列冷诱导基因COR表达,从而使转基因植株的抗寒性得到提高。本研究以栽培品种‘美人指’葡萄(Vitis vinifera L.’Manicure Finger’)和砧木品种’1202’(Mourvedre×Rupestris)葡萄为材料,采用农杆菌介导法将ICE基因导入‘美人指’葡萄中并对转基因株系做抗寒鉴定；建立‘1202’葡萄砧木不定芽再生体系并通过花粉管通道法将ICE基因导入难以转化的‘1202’葡萄砧木中,获得抗寒性较强的转基因葡萄,以期培育葡萄新种质。本研究结果如下：1.通过农杆菌介导法,将从山葡萄中克隆的ICE基因转到‘美人指’葡萄中,经过潮霉素筛选,总共获得5个转基因抗性株系。GUS瞬时表达检测5个抗性株系,结果均呈阳性；经过PCR检测,5株GUS阳性株系均检测到目的条带；进一步进行RT-PCR检测,初步证实,有3个生根株系的ICE基因已经整合进‘美人指’葡萄的基因组中。2.经过前期分子检测得到的3株美人指转基因葡萄株系,将其做低温处理并表型分析,从而筛选出最抗寒株系。对最抗寒的株系测定丙二醛(MDA)、可溶性糖(soluble suger)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、脯氨酸(praline)等生理指标。结果表明：通过导入ICE基因,植物体内的MDA含量减少,SOD、POD、CAT的活性及游离脯氨酸的含量提高,从而转基因葡萄的抗寒能力增强。3.以葡萄砧木‘1202’为试材,研究了不同外植体类型、不同植物生长调节剂浓度及配比、外植体放置方式等对其不定芽再生频率的影响。结果表明：叶片的再生效果最好,最高再生频率为68.78%,最适宜葡萄砧木‘1202’不定芽再生的培养基为MS+TDZ1.0mg/L+IBA0.01mg/L+蔗糖30g/L+5.5g/L琼脂,pH5.8,最适宜叶片放置方式为近轴面接触培养基。在上述条件下,研究建立起葡萄砧木‘1202’离体不定芽再生体系,再生的葡萄苗40天后移栽,达到90%的成活率。4.以‘1202’葡萄砧木的花序为转化ICE基因的受体,农杆菌介导并结合花粉管通道法对‘1202’葡萄进行转化,利用GUS染色、PCR和RT-PCR方法检测,共得到3株GUS阳性株系,3株PCR阳性株系,1株RT-PCR阳性株系,初步说明已经整合ICE基因的‘1202’葡萄得到表达。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词  11-12
引言  12-13
第一章 文献综述  13-37
  1 葡萄转基因研究进展  13-20
    1.1 植物转基因历史和现状  13-14
    1.2 各种转基因方法  14-18
    1.3 农杆菌遗传转化效率的影响因素  18-19
    1.4 葡萄遗传转化发展现状及存在问题  19-20
  2 葡萄抗寒性研究进展  20-24
    2.1 葡萄抗寒生理  21-22
    2.2 葡萄抗寒性鉴定方法  22-23
    2.3 葡萄防寒措施研究进展  23-24
    2.4 葡萄抗寒研究展望  24
  3 抗寒基因工程  24-29
    3.1 抗冻蛋白  25
    3.2 植物渗透调节物质  25-26
    3.3 脂肪酸去饱和酶  26
    3.4 氧化酶系统  26-27
    3.5 抗寒相关基因  27-29
  参考文献  29-37
第二章 农杆菌介导ICE基因转化‘美人指’  37-47
  摘要  37
  1 材料与方法  37-42
    1.1 材料  37-39
    1.2 方法  39-42
  2 结果与分析  42-44
    2.1 ‘美人指’葡萄转基因株系的获得  42-43
    2.2 转基因植株的PCR鉴定  43
    2.3 RT-PCR的检测结果  43-44
  3 讨论  44-46
  参考文献  46-47
第三章 转ICE基因美人指植株的抗寒性鉴定  47-63
  摘要  47
  1 材料与方法  47-50
    1.1 材料  47
    1.2 方法  47-49
    1.3 转基因植株中ICE基因相对表达量分析  49-50
  2 结果与分析  50-58
    2.1 低温处理表型分析  50-51
    2.2 抗寒性生理指标的测定  51-57
    2.3 转基因植株中ICE基因相对表达量分析  57-58
  3 讨论  58-60
  参考文献  60-63
第四章 葡萄砧木‘1202’离体再生体系的建立  63-73
  摘要  63
  1 材料和方法  63-65
    1.1 植物材料  63
    1.2 方法  63-65
    1.3 数据统计方法  65
  2 结果与分析  65-69
    2.1 不同外植体类型对‘1202’葡萄不定芽再生的影响  65
    2.2 不同激素浓度配比对‘1202’葡萄叶片再生的影响  65-66
    2.3 不同激素浓度配比对‘1202’葡萄叶柄再生的影响  66-67
    2.4 不同激素浓度配比对‘1202’葡萄茎段再生的影响  67-68
    2.5 叶片不同放置方式对‘1202’葡萄不定芽再生的影响  68
    2.6 不同基因型对葡萄不定芽再生的影响  68-69
  3 不定芽的生根及驯化移栽  69
  4 讨论  69-70
  5 结论  70-71
  参考文献  71-73
第五章 花粉管通道法介导ICE基因转化葡萄砧木‘1202’的研究  73-81
  摘要  73
  1 材料与方法  73-75
    1.1 材料  73-74
    1.2 方法  74-75
  2 结果与分析  75-77
    2.1 转化植株的获得  75
    2.2 GUS染色检测  75
    2.3 PCR检测  75-76
    2.4 RT-PCR检测  76-77
  3 讨论  77-78
  参考文献  78-81
全文结论  81-83
主要创新点  83-85
附录  85-91
硕士在读期间发表论文  91-93
致谢  93

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 浆果类 > 葡萄
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