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‘金坠梨’自交亲和性分子遗传分析及MdSFBB9α和MdSFBB9β基因功能研究

作　者: 武军凯
导　师: 李天忠
学　校: 中国农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果 ‘鸭梨’ ‘金坠梨’ 自交不亲和花粉败育
分类号: S661.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

植物自交不亲和性是指功能正常的雌雄同花植物在自花授粉时不能产生合子的现象和机制,其广泛存在于植物界中,对植物的遗传多样性以及适应自然选择的能力具有很重要的意义。早期遗传学研究认为大多数植物自交不亲和机制由单一的复等位基因位点来控制,即自交不亲和位点—S-位点(S-locus),该位点至少包含两类基因,即花柱S基因和花粉S基因。在茄科和蔷薇科植物的自交不亲和中,花柱S基因编码了一类T2家族的核酸酶(S-RNase),花粉S基因编码了一类F-box蛋白(S-locus F-box,SLF/S-locus F-box brothers,SFBB).最新研究表明,在茄科及蔷薇科中,花柱与花粉S因子通过一个相似的自交不亲和识别体统,即‘多因子协同参与的非自我识别系统’,进行‘自己’与‘异己’的识别进而实现授粉的亲和与否,因此识别系统中自交不亲和因子的突变往往导致了自交亲和性突变体产生。在本研究中,我们首先对‘鸭梨’的一个自交亲和性突变体‘金坠梨’进行了分子遗传分析;其次,为了研究蔷薇科及茄科中自交不亲和系统的保守性,我们选取‘富士’苹果中两个花粉S基因MdSFBB9α和MdSFBB9β转化茄科植物进行了功能研究。实验结果包括以下两个方面：1.为了研究‘鸭梨’花粉部分突变体‘金坠梨’的自交亲和性突变机制,首先,从‘鸭梨’中同源克隆得到了5个F-box基因,氨基酸序列分析显示,它们均具有典型的F-box结构域；特异性RT-PCR显示这五个F-box基因均为花粉组织特异性表达；遗传连锁分析表明它们均为S位点的SLF基因；核酸序列比对分析表明,‘鸭梨’中共7个SLF基因均在‘金坠梨’梨中正常表达。其次,通过分子遗传学方法,进一步研究了‘鸭梨’花粉部分突变体‘金坠梨’自交亲和的原因,实验结果表明,‘金坠梨’自交亲和性突变不是由花粉s因子突变导致的,而是非S位点的因子突变导致的；同时,细胞学观察表明‘金坠梨’花粉母细胞的减数分裂行为异常,其花粉败育率明显高于‘鸭梨’。本研究首次在蔷薇科苹果亚科中发现了由非S因子突变导致的自交亲和性突变体,为蔷薇科自交不亲和机制的研究提供了重要的实验依据。2.为了验证蔷薇科植物的花粉S基因的功能以及蔷薇科和茄科植物自交不亲和系统的相似性,从‘富士’苹果中克隆到了与S-RNase紧邻的两个SFBBs基因—MdSFBB9α和MdSFBB9β,将克隆得到的‘富士’SFBBs基因转化到茄科矮牵牛中。授粉实验结果显示,MdSFBB9β作为花粉S基因能够打破转基因矮牵牛的自交不亲和性,这表明‘富士’MdSFBB9β在矮牵牛中具有花粉S因子的功能,花粉S因子在茄科及蔷薇科植物自交不亲和系统中的功能相对保守,同时该实验为研究茄科及蔷薇科之间自交不亲和系统的保守性提供了重要的实验证据。综上所述,本研究通过对‘金坠梨’自交亲和性机制的研究,首次在苹果亚科中发现了非S因子突变导致的自交亲和性突变体,为蔷薇科自交不亲和机制的研究提供了重要数据;其次,蔷薇科与茄科间的转基因实验为茄科和蔷薇科自交不亲和系统在进化上的同起源提供了证据。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-8
缩略词  8-9
第一章文献综述  9-21
  1.1 自交不亲和性概述  9-11
    1.1.1 自交不亲和性的定义  9
    1.1.2 植物自交不亲和性的分类和遗传控制  9-11
  1.2 自交不亲和反应因子及作用机制  11-17
    1.2.1 自交不亲和反应与pistil-S因子  11-13
    1.2.2 自交不亲和反应与pollen-S因子  13-15
    1.2.3 自交不亲和反应与非S因子  15-16
    1.2.4 自交不亲和的作用机制：降解模型和细胞区室化模型  16-17
  1.3 蔷薇科自交不亲和突变体的研究进展  17-19
    1.3.1 花柱自交亲和性突变体的研究进展  17-18
    1.3.2 花粉自交亲和性突变体的研究进展  18-19
  1.4 研究目的与意义  19-21
第二章 ‘鸭梨’花粉S基因的鉴定  21-36
  2.1 材料与方法  21-28
    2.1.1 试验材料与试剂  21-23
    2.1.2 试验方法  23-28
  2.2 结果与分析  28-34
    2.2.1 ‘鸭梨’花粉F-box基因的克隆及基因序列分析  28-29
    2.2.2 ‘鸭梨’花粉F-box基因的组织特异性分析  29-30
    2.2.3 ‘鸭梨’花粉F-box基因与S-RNase的连锁分析  30-31
    2.2.4 ‘鸭梨’花粉F-box基因的进化树分析  31-33
    2.2.5 ‘鸭梨’花粉F-box蛋白的序列特征与空间结构分析  33-34
  2.3 讨论  34-36
    2.3.1 ‘鸭梨’SLF基因的克隆与鉴定  34-35
    2.3.2 ‘鸭梨’SLF的结构分析  35-36
第三章 ‘金坠梨’自交亲和突变的分子遗传分析  36-55
  3.1 材料与方法  36-40
    3.1.1 试验材料和器材  36
    3.1.2 试验方法  36-40
  3.2 结果与分析  40-51
    3.2.1 ‘鸭梨’及其芽变‘金坠梨’授粉坐果率调查  40-41
    3.2.2 ‘鸭梨’及其芽变‘金坠梨’单果实平均结籽数与单果平均质量调查  41-42
    3.2.3 ‘金坠梨’花粉S基因的克隆及序列比对  42-43
    3.2.4 ‘金坠梨’自交及与‘鸭梨’,‘锦丰梨’‘寒香梨’杂交后代S-RNase基因型的鉴定  43-46
    3.2.5 Southern blot分析‘金坠梨’自交后代  46-47
    3.2.6 ‘金坠梨’花粉形态学观察  47-48
    3.2.7 ‘金坠梨’花粉母细胞减数分裂观察  48-50
    3.2.8 ‘金坠梨’自交后代染色体数目的观察  50-51
  3.3 讨论  51-55
    3.3.1 非S位点的花粉修饰因子参与到了自交不亲和过程中  51
    3.3.2 ‘金坠梨’非S位点的花粉修饰因子突变可能导致了减数分裂异常  51-54
    3.3.3 ‘金坠梨’自交后代存在着近交衰退现象  54-55
第四章 ‘富士’苹果花粉S基因MdSFBB9α和MdSFBB9β的功能分析  55-72
  4.1 材料与方法  55-62
    4.1.1 试验材料与试剂  55-56
    4.1.2 试验方法  56-62
  4.2 结果与分析  62-67
    4.2.1 ‘富士’花粉S基因的克隆及基因序列分析  62
    4.2.2 载体构建  62-63
    4.2.3 Southern blot鉴定MdSFBB9α和MdSFBB9β转基因株系  63
    4.2.4 MdSFBB9α和MdSFBB9β转基因分析  63-65
    4.2.5 MdSFBB9α和MdSFBB9β与矮牵牛S_3-RNase、S_(3L)-RNase酵母互作实验  65-67
  4.3 讨论  67-72
    4.3.1 ‘富士’苹果MdSFBB9α和MdSFBB9β基因的克隆和分析  67-68
    4.3.2 苹果花粉MdSFBB9α和MdSFBB9β转基因实验  68-70
    4.3.3 ‘富士’花粉S基因MdSFBB9α和MdSFBB9β酵母双杂交实验  70-72
结论  72-73
参考文献  73-84
致谢  84-85
个人简历  85

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