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苹果果实发育及成熟进程中乙烯发生的信号转导机制

作　者: 李兴亮
导　师: 贾文锁
学　校: 中国农业大学
专　业: 果树学
关键词: 乙烯 SnRK2.4 信号转导果实成熟
分类号: S661.1
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

果树果实发育和成熟调控是果树学科的核心问题之一。多年来的研究表明,跃变型果实的成熟是由植物激素乙烯操纵的,但对果实中乙烯信号起源的机制却几乎没有深入了解。苹果是重要的果树品种之一,也是典型的呼吸跃变型果实。本论文以‘金冠’苹果为试材,从细胞信号转导的角度,对果实发育过程中乙烯信号起源的机制进行了研究。主要结果和结论如下：1.通过生物信息学分析,在苹果中共鉴定9个蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK2s亚家族成员。该亚家族成员均含有ATP结合位点及Ser/Thr激酶结构域,属于PKc类蛋白激酶。对SnRK2s亚家族全部成员的时空表达分析表明,MdSnRK2.4的表达特征与果实发育和成熟进程尤为一致,意味着MdSnRK2.4在苹果果实发育和成熟过程中可能起着重要作用。2. MdSnRK2.4在番茄’Micro Tom’中的稳定表达不仅可以促进果实发育还可以影响植物的一系列形态建成,如植株矮化、叶绿素含量上升、叶绒毛变长、叶肉细胞膨大及密度降低等。这些特征都与乙烯调控有关,说明MdSnRK2.4是操纵乙烯信号起源的上游信号蛋白。3. MdSnRK2.4在苹果果实愈伤中瞬时表达促进了乙烯合成关键酶MdACO1基因的表达及乙烯的释放,相反,MdSnRK2.4的RNAi沉默抑制了MdACO1的表达及乙烯的释放。MdSnRK2.4在番茄果实中异源过表达可显著促进乙烯合成及番茄果实成熟进程。进一步研究表明,在玉米原生质体中,MdSnRK2.4的瞬时表达可促进MdACO1启动子驱动的LUC报告基因的表达。这些数据表明,MdSnRK2.4为操纵MdACO1基因表达的上游信号蛋白,因而在乙烯合成及果实成熟调控中起着重要作用。4.通过酵母双杂交、双分子荧光互补及Pull-down检测证明,MdSnRK2.4与MdACO1转录因子MdHB存在物理互作,互作区域发生在MdSnRK2.4功能域STKC (Ser/Thr protein kinase c)与MdHB功能域HD (Homeobox domain)之间。利用原核菌株表达体系及磷酸化位点质谱检测发现,MdSnRK2.4与MdHB之间的互作导致MdHB蛋白磷酸化,磷酸化位点位于MdHB中HD结构域的三个苏氨酸位点,即T82、T95、T131。酵母双杂交、酵母单杂交检测发现,点突变该三个苏氨酸位点后MdHB与MdSnRK2.4互作强度及其对MdACO1启动子的启动活性下降。表明,MdSnRK2.4对MdHB的功能调控是通过磷酸化修饰机制。综上所述,本研究揭示了MdSnRK2.4为操纵乙烯信号产生的重要信号蛋白,其分子机制在于,MdSnRK2.4可以通过与MdACO1转录因子MdHB的直接互作,对MdHB功能域进行磷酸化修饰以调控MdHB的活性,进而调控MdACO1的表达,因而最终操纵了乙烯的产生。该研究不仅解析了苹果果实发育过程中乙烯信号产生的分子机制,对今后苹果分子改良也具有重要的指导意义。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
第一章文献综述  9-21
  1.1 苹果果实品质形成与影响因素  9-11
    1.1.1 苹果果实的成熟与品质形成  9
    1.1.2 生态因子与品质形成  9-10
    1.1.3 激素、逆境与果实品质形成  10-11
  1.2 乙烯信号调控机制与植物抗逆  11-16
    1.2.1 乙烯合成路径调控  12-13
    1.2.2 乙烯信号转导途径调控  13-15
    1.2.3 乙烯在植物抗性反应中的作用  15-16
  1.3 SnRK家族及其生物学功能  16-20
    1.3.1 SnRK1亚家族  16-18
    1.3.2 SnRK2亚家族  18-20
    1.3.3 SnRK3亚家族  20
  1.4 研究目的与意义  20-21
第二章 ‘金冠’苹果果实中SnRK2s的克隆及表达分析  21-29
  引言  21
  2.1 材料与方法  21-23
    2.1.1 试验材料  21
    2.1.2 试剂与仪器  21-22
    2.1.3 溶液的配制  22
    2.1.4 试验方法  22-23
  2.2 结果与分析  23-27
    2.2.1 ‘金冠’苹果果实SnRK2亚家族进化分析  23-24
    2.2.2 MdSnRK2s亚家族时空表达检测  24-26
    2.2.3 MdSnRK2s非生物胁迫应答检测  26-27
  2.3 讨论  27-29
第三章 MdSnRK2.4转基因番茄的理化分析  29-39
  引言  29
  3.1 材料与方法  29-31
    3.1.1 试验材料  29
    3.1.2 试剂与仪器  29
    3.1.3 溶液的配制  29-30
    3.1.4 试验方法  30-31
  3.2 结果与分析  31-35
    3.2.1 MdSnRK2.4转基因番茄的鉴定及表型观察  31-32
    3.2.2 MdSnRK2.4转基因番茄叶绒毛显微观察分析  32-35
    3.2.3 MdSnRK2.4加速转基因番茄果实的成熟进程  35
  3.3 讨论  35-39
    3.3.1 乙烯对植物体形态建成的影响  35-36
    3.3.2 叶绒毛与植物体抗性的关系  36-39
第四章 MdSnRK2.4与乙烯信号路径的相关性分析  39-50
  引言  39
  4.1 材料与方法  39-43
    4.1.1 试验材料  39
    4.1.2 试剂与仪器  39-40
    4.1.3 溶液的配制  40
    4.1.4 试验方法  40-43
  4.2 结果与分析  43-48
    4.2.1 瞬时表达MdSnRK2.4促进番茄果实的成熟  43-45
    4.2.2 MdSnRK2.4通过MdACO1调控乙烯合成  45-47
    4.2.3 过表达MdSnRK2.4增强MdACO1启动子的转录活性  47-48
  4.3 讨论  48-50
    4.3.1 功能基因的快速筛选与鉴定  48-49
    4.3.2 功能相关基因中间组分的研究  49-50
第五章 MdSnRK2.4调控乙烯合成关键酶MdACO1的机理研究  50-67
  引言  50
  5.1 材料与方法  50-56
    5.1.1 试验材料  50-51
    5.1.2 试剂与仪器  51
    5.1.3 溶液的配制  51-52
    5.1.4 试验方法  52-56
  5.2 结果与分析  56-62
    5.2.1 MdSnRK2.4与MdHB互作的验证  56-59
    5.2.2 MdSnRK2.4磷酸化修饰激活MdHB  59-60
    5.2.3 点突变MdHB磷酸化位点影响其蛋白互作及转录活性  60-62
  5.3 讨论  62-67
    5.3.1 蛋白结构互作的验证  62-64
    5.3.2 蛋白磷酸化修饰的研究方法  64-65
    5.3.3 转录因子HD-Zip家族在植物体中的功能  65
    5.3.4 MdSnRK2.4介导植物体对环境的感知  65-67
小结与结论  67-68
参考文献  68-75
致谢  75-76
附录  76-79
作者简历  79

苹果果实发育及成熟进程中乙烯发生的信号转导机制

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