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北方强冬性白菜型冬油菜抗寒性评价及抗寒机制研究

作　者: 史鹏辉
导　师: 孙万仓
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 冬油菜抗寒性评价生理生化细胞结冰抗冻蛋白
分类号: S634.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本文对不同抗寒性冬油菜品种的生理生化特性和POD同工酶谱进行了研究，通过对抗寒性相关指标进行筛选，建立起一个综合的冬油菜抗寒评价模型，并对强冬性白菜型冬油菜的抗寒性机制进行了较深入的探索，主要结果如下：1.对抗氧化酶活性（SOD、CAT和POD）和丙二醛含量（MDA）及过氧化物同工酶分析结果表明，在温和的环境中，白菜型冬油菜相比甘蓝型冬油菜有更高的抗氧化酶活性和更低的脂质过氧化水平，说明白菜型冬油菜的抗逆性强于甘蓝型冬油菜，特别是白菜型冬油菜的过氧化物酶活性平均值是甘蓝型冬油菜的10倍之高。23个受试品种（系）的POD同工酶分析共发现67条酶带，白菜型冬油菜和甘蓝型冬油菜都存在其特征谱带，不同品种间在带型分布及显色强度上存在差异。白菜型冬油菜‘Largo’、‘Prisma黑’和‘Prisma黄’的p4酶带和甘蓝型冬油菜一致，表明这三个材料和甘蓝型冬油菜有较近的亲缘关系。2.以半致死温度（LT50）为参考指标，对受试材料叶片的生理生化、叶片解剖结构等抗寒性指标进行相关分析，筛选出了与抗寒密切相关的生理生化指标和生物学性状，此外，对不同抗寒性油菜叶片气孔的分析显示，强抗寒性品种叶片其气孔相对较小，这与前人研究结果不同；并建立了一个抗寒性评价的多元回归模型：Y=﹣18.362－0.034X1＋0.512X2－6.086X3＋0.14X4＋0.008X5－0.001X6（Y-半致死温度；X1-5~0℃POD活性变化量；X2-0~-5℃CAT活性变化量；X3-栅海比；X4-栅栏组织厚度；X5-叶片厚；X6-气孔大小）。通过回归方程的显著性检测、回代检验以及结合直接的抗寒冷冻形态分级法，表明这个多元回归模型具有较高的可靠性。3.基于抗氧化酶活性与细胞冰冻状态间的相关性模型，用4个冷驯化的不同抗寒性油菜品种的根为材料，于低温试验箱内进行连续降温处理（4℃24h，0℃24h，-3℃24h，-6℃24h，-9℃24h，-15℃24h，-21℃24h），通过检测其抗氧化酶活性（POD,CAT）并结合POD同工酶电泳，发现强抗寒性油菜品种根部POD和CAT的活性在降温初期变化较小，后期持续大幅增加；而弱抗寒性品种在降温初期POD和CAT的活性有较大幅度的变化，之后就保持恒定不再改变。实验结果显示弱抗寒性油菜品种根细胞在降温处理后期完全冻结，而强抗寒性的能通过某种机制避免细胞结冰，保持细胞的溶液状态（过冷却态）。表明强抗寒油菜品种能安全越冬的关键是避免细胞内结冰，其结冰温度越低，抗寒性越强。弱抗寒性的油菜品种则是因为细胞内结冰产生的致死性损伤才无法安全越冬。此外实验结果表明强抗寒性品种根部可能存在高活性的抗冻蛋白。4.通过光学显微镜观察法对低温诱导的超强抗寒性冬油菜陇油6号的叶片和根的质外体粗提物抗冻活性检测表明，其质外体粗提物具有明显的冰晶形态修饰活性和重结晶抑制活性，表明冬季冬油菜叶片和根的非质体中有抗冻蛋白。通过SDS-PAGE凝胶电泳直接分离质外体蛋白并结合MALDI-TOF/TOF质谱，鉴定出多种功能尚不明确的蛋白质，发现其中有几种蛋白（如类葡聚糖酶）与冬黑麦中报道的抗冻蛋白一致。对叶片质外体中的类葡聚糖酶进行了SDS-PAGE回收及抗冻活性测试，证实这个类葡聚糖酶具有较弱的冰晶形态修饰作用，说明低温诱导的叶片质外体类葡聚糖酶在油菜中也扮演抗冻蛋白的角色。由于质外体粗提液的重结晶抑制活性极强，且低温诱导后存在许多功能尚未明确的蛋白质，推测冬季强抗寒性冬油菜质外体中可能存在多种未被发现的抗冻蛋白。

全文目录

摘要  2-4
SUMMARY  4-6
缩略词表  6-10
第一章文献综述  10-22
  1 油菜概况  10-11
    1.1 油菜的经济地位  10
    1.2 油菜的分布和产区  10-11
  2 植物抗寒性研究概况  11-17
    2.1 冬油菜冻害的主要类型  11-12
    2.2 国内外抗寒性研究现状  12-14
    2.3 结冰对植物的伤害  14
    2.4 低温驯化与抗冻蛋白  14-17
  3 植物抗寒性的评价  17-19
  4 蛋白质谱鉴定技术  19-20
  5 本研究的意义及主要内容  20-22
第二章不同类型冬油菜抗氧化酶特性及过氧化物同工酶分析  22-33
  1 材料与方法  22-23
    1.1 实验材料  22
    1.2 实验方法  22
    1.3 数据分析  22-23
  2 结果与分析  23-29
    2.1 不同类型冬油菜的植物学特征  23-24
    2.2 不同类型冬油菜的抗氧化酶活性和丙二醛含量分析  24-26
    2.3 不同类型冬油菜的 POD 同工酶酶谱分析  26-28
    2.4 23 份油菜的 POD 同工酶聚类发生图  28-29
  3 讨论  29-31
    3.1 抗寒性与植株的生长发育状况及植物学特征有密切关系  29
    3.2 在相对温和的生长环境下白菜型油菜比甘蓝型油菜有更高的抗氧化酶活性和更低的脂质过氧化水平  29-30
    3.3 冬油菜的 POD 除抗氧化作用外可能还有调节株高等功能  30-31
    3.4 POD 同工酶为鉴定油菜的亲缘关系及抗寒性强弱提供依据  31
  4 小结  31-33
第三章冬油菜抗寒性评价体系建立  33-44
  方案 1：基于生理生化指标的综合抗寒性评价模型  33-38
    1 材料与方法  33-34
      1.1 试验材料  33
      1.2 试验方法  33-34
      1.3 数据处理与分析  34
    2 结果与分析  34-38
      2.1 不同油菜品种的半致死温度（LT50）  34
      2.2 各生理生化指标及叶片解剖结构特征与半致死温度（LT50）的相关性  34-37
      2.3 抗寒性评价的多元回归模型  37-38
  方案 2：基于油菜幼苗冷冻形态的抗寒性分级法  38-43
    1 材料与方法  38-39
      1.1 实验材料  38
      1.2 实验方法  38-39
    2 结果与分析  39-43
      2.1 不同类型冬油菜幼苗在冷冻后的形态变化特征  39-41
      2.2 油菜苗期抗寒性判定规则建立  41-42
      2.3 油菜幼苗冷冻形态分级  42-43
  讨论  43
    3.1 冷冻法进行抗寒性分级的可靠性  43
    3.2 两种抗寒性评价方法的比较  43
  小结  43-44
第四章低温下抗氧化酶活性与冬油菜根细胞结冰关系的研究  44-53
  1 材料和方法  45-46
    1.1 实验材料  45
    1.2 实验方法  45-46
    1.3 数据处理  46
  2 结果与分析  46-50
    2.1 实验假设的体外验证（低温冷冻对酶提取液中 POD 活性的影响）  46-47
    2.2 不同品种油菜根在连续低温下 POD 和 CAT 活性的变化  47-49
    2.3 不同品种根在连续低温下 POD 同工酶谱特征  49-50
  3 讨论  50-52
    3.1 低温下冬油菜根部抗氧化酶活性变化和根部细胞冰冻状态之间存在相关性  50-51
    3.2 避免胞内结冰可能是强抗寒冬油菜抵御冰冻危害的重要机制之一  51
    3.3 陇油 6 号等强抗寒性品种中可能存在高活性的抗冻蛋白  51-52
    3.4 抗氧化酶可作为研究某些越冬植物胞内冰晶形成(IIF)温度的指示因子  52
  4 小结  52-53
第五章冬油菜中抗冻蛋白的研究初探  53-77
  1 材料与方法  53-57
    1.1 材料  53
    1.2 化学试剂及仪器  53
    1.3 实验材料处理方法  53-54
    1.4 蛋白质提取  54
      方案 1：提取热稳定蛋白  54
      方案 2：提取质外体蛋白  54
    1.5 蛋白质浓度测定  54-55
    1.6 质外体粗提液抗冻活性测定  55
    1.7 SDS 电泳（SDS-PAGE）  55-56
    1.8 SDS-PAGE 蛋白质条带回收  56
    1.9 差异蛋白质谱检测  56-57
  2 结果与分析  57-74
    2.1 蛋白含量分析  57-60
      2.1.1 冷驯化过程中陇油 6 号叶片质外体蛋白含量变化  57-58
      2.1.2 冷驯化过程中陇油 6 号叶片总蛋白和热稳定蛋白含量变化  58-60
    2.2 冷驯化过程中陇油 6 号蛋白表达的 SDS-PAGE 分析  60-61
    2.3 陇油 6 号质外体蛋白的抗冻活性分析  61-65
    2.4 陇油 6 号质外体蛋白 SDS-PAGE 取样  65
    2.5 陇油 6 号质外体差异表达蛋白质谱鉴定结果  65-66
    2.6 质谱结果图（以 Basic glucanase 为例）：  66-68
    2.7 冷诱导的陇油 6 号质外体蛋白功能的探讨  68-71
    2.8 冷诱导的陇油 6 号叶片全蛋白中热稳定蛋白功能的探讨  71-72
    2.9 陇油 6 号部分质外体蛋白（类葡聚糖酶）的回收及活性测试  72-74
  3. 讨论  74-76
    3.1 冷诱导的陇油 6 号叶和根部质外体中存在抗冻蛋白  74
    3.2 冷诱导的陇油 6 号叶片质外体中的类葡聚糖酶可能是一种抗冻蛋白  74
    3.3 强抗寒性冬油菜中可能存在多种未知的抗冻蛋白  74-75
    3.4 冷诱导的陇油 6 号叶片热稳定蛋白中尚未检测到抗冻活性  75-76
  4 小结  76-77
第六章全文结论  77-79
致谢  79-80
参考文献  80-88
导师简介  88-89

北方强冬性白菜型冬油菜抗寒性评价及抗寒机制研究

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