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根癌农杆菌介导甘蔗遗传转化技术研究

作　者: 蔡澜峰
导　师: 陈平华
学　校: 福建农林大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 甘蔗 根癌农杆菌 愈伤组织 心叶 悬浮细胞 遗传转化
分类号: S566.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


农杆菌介导转基因方法由于所转入的外源基因拷贝数少、遗传稳定等优点,一直是科学工作者重点研究的方法。甘蔗是转基因安全等级最高的作物之一,但迄今尚未建立稳定的农杆菌介导转基因技术体系。本研究以商业化生产的含gus基因质粒pCAMBIA2301为载体,在用模式作物烟草测试五种农杆菌菌株EHA105、LBA4404、AGL1、GV3101和A281侵染能力的前提下,分别以五个甘蔗品种ROC22、FN15、FN28、FN30、FN39为受体材料,分愈伤组织、心叶、悬浮细胞三种靶组织类型,对5种农杆菌菌株介导的遗传转化方法进行了一系列优化。主要研究结果如下：1.烟草测试结果证明：五种农杆菌工程菌株EHA105/pCAMBIA2301、 LBA4404/pCAMBIA2301、AGL1/pCAMBIA2301、GV3101/pCAMBIA2301和A281/pCAMBIA2301均具有侵染能力；所用侵染体系适合五种农杆菌工程菌株的侵染试验；2.甘蔗愈伤组织遗传转化方法优化实验结果显示农杆菌侵染具有种属特异性,其中以甘蔗品种ROC22侵染效率最高,达到71%；侵染条件为愈伤组织诱导25d,在分化培养基上预培养6d,侵染前在含有500μmol/L乙酰丁香酮(AS)的MS培养液中浸泡6h, EHA105农杆菌液OD600为1.0,侵染液为MS+葡萄糖68.5g/L+精氨酸174mg/L+谷氨酰胺876mg/L+30g/L蔗糖+AS100μmoI/L,pH5.4,侵染50min,共培养5d,共培养温度为25℃时,有利于甘蔗胚性愈伤的遗传转化；FN15用GV3101/pCAMBIA2301和FN30用EHA105/pCAMBIA2301也得到一定的侵染效率,FN39在所有处理中很难侵染。3.甘蔗心叶遗传转化体系优化实验结果显示,甘蔗品种FN30在EHA105农杆菌液OD600为1.0时,侵染液为MS+葡萄糖68.5g/L+精氨酸174mg/L+谷氨酰胺876mg/L+30g/L蔗糖+AS100μmol/L (pH5.4),侵染50min,共培养3d,共培养温度25℃时,有利于甘蔗心叶的遗传转化；FN15、FN28、FN39侵染效率较低；ROC22侵染困难。4.以质地疏松、易分散的ROC22和FN15的愈伤组织为外植体,建立甘蔗的悬浮细胞系,初步研究了甘蔗悬浮细胞的生长特性。结果表明,最适合甘蔗悬浮细胞生长的培养基为MS+2.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖。甘蔗悬浮细胞的生长可以明显分为3个阶段：延迟期(0-4d)、指数生长期(5-8d)、静止期(9-14d),由此进一步确定了甘蔗细胞的最佳继代周期为6-8d；甘蔗悬浮细胞遗传转化体系优化实验结果显示,甘蔗品种ROC22的悬浮细胞继代7d,在EHA105农杆菌液OD600为1.0,侵染液为MS+葡萄糖68.5g/L+精氨酸174mg/L+谷氨酰胺876mg/L+30g/L蔗糖--AS100μmol/L (pH5.4),侵染50min,共培养3d,共培养温度25℃时,有利于甘蔗悬浮细胞的遗传转化；FN15侵染困难。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-14
1 文献综述  14-27
  1.1 植物基因工程研究进展及应用  14
  1.2 甘蔗遗传转化的方法  14-19
    1.2.1 基因枪转化法  15-17
    1.2.2 农杆菌介导法  17-18
    1.2.3 电击法  18
    1.2.4 聚乙二醇(PEG)介导法  18-19
  1.3 影响农杆菌介导单子叶植物遗传转化因素的研究  19-24
    1.3.1 农杆菌菌株类型  19-20
    1.3.2 植物基因型及外植体类型  20-21
    1.3.3 外植体的预培养  21
    1.3.4 培养基成分  21-22
    1.3.5 菌液浓度及侵染时间  22-23
    1.3.6 共培养时间  23
    1.3.7 共培养温度和培养基pH值  23
    1.3.8 受体植物的再生体系  23-24
  1.4 单子叶植物常用的报告基因  24-25
  1.5 植物细胞的悬浮培养  25
  1.6 本研究的目的和意义  25-27
2 农杆菌侵染体系预实验  27-43
  2.1 材料  27-29
    2.1.1 转化受体  27
    2.1.2 菌株与质粒  27-28
    2.1.3 生化试剂  28-29
    2.1.4 仪器设备  29
  2.2 培养基  29-30
  2.3 方法  30-36
    2.3.1 转化受体的制备  30
    2.3.2 农杆菌感受态细胞的制备和转化子的验证  30-34
      2.3.2.1 农杆菌的纯化  30
      2.3.2.2 农杆菌感受态细胞的制备  30-31
      2.3.2.3 双元载体转化农杆菌  31
      2.3.2.4 农杆菌单菌落的保存与培养  31
      2.3.2.5 农杆菌转化子的鉴定  31-34
        2.3.2.5.1 农杆菌转化子的PCR检测  31-33
        2.3.2.5.2 农杆菌转化子的酶切鉴定  33-34
    2.3.3 工程菌的制备  34
    2.3.4 农杆菌转化烟草流程  34
    2.3.5 转化子的筛选  34
    2.3.6 GUS染色  34-36
      2.3.6.1 GUS染色液的配制  34-35
      2.3.6.2 烟草叶片GUS瞬时表达  35-36
  2.4 结果与分析  36-43
    2.4.1 农杆菌转化子的鉴定  36-41
      2.4.1.1 农杆菌转化子nptⅡ基因的PCR鉴定  36
      2.4.1.2 农杆菌转化子gus基因的PCR鉴定  36-38
      2.4.1.3 农杆菌转化子的酶切鉴定  38-41
    2.4.2 烟草叶片GUS瞬时表达分析  41-43
3 农杆菌介导甘蔗愈伤组织遗传转化技术研究  43-60
  3.1 材料  43
    3.1.1 甘蔗品种  43
    3.1.2 转化受体  43
    3.1.3 工程菌株与质粒  43
    3.1.4 生化试剂  43
    3.1.5 主要仪器  43
  3.2 培养基  43-44
  3.3 方法  44-48
    3.3.1 转化受体的制备  44
      3.3.1.1 甘蔗愈伤组织的诱导  44
      3.3.1.2 甘蔗愈伤组织的继代  44
    3.3.2 头孢霉素和Timentin的抑菌试验  44-45
      3.3.2.1 抑菌圈试验  44-45
      3.3.2.2 抑菌时间试验  45
      3.3.2.3 头孢霉素和Timentin对共培养愈伤组织抑菌作用预试验  45
    3.3.3 农杆菌感受态细胞的制备和转化子的验证  45-48
      3.3.3.1 主要影响因素的实验设计  45-46
      3.3.3.2 受试甘蔗品种  46
      3.3.3.3 愈伤组织状态  46
      3.3.3.4 愈伤组织预培养时间  46
      3.3.3.5 愈伤组织化学诱导预处理  46-47
      3.3.3.6 菌株的选择及培养  47
      3.3.3.7 菌液浓度  47
      3.3.3.8 侵染  47
      3.3.3.9 共培养  47-48
      3.3.3.10 筛选培养  48
    3.3.4 愈伤组织GUS瞬时表达  48
      3.3.4.1 GUS染色液的配制  48
      3.3.4.2 愈伤组织GUS瞬时表达率分析  48
    3.3.5 甘蔗抗性愈伤率分析  48
  3.4 结果与分析  48-56
    3.4.1 头孢霉素和Timentin固体培养对农杆菌的抑制效果比较  48-52
      3.4.1.1 头孢霉素和Timentin的抑菌圈试验  48-49
      3.4.1.2 头孢霉素和Timentin抑菌时间的确定  49-50
      3.4.1.3 头孢霉素和Timentin对共培养愈伤组织的影响  50-52
    3.4.2 不同基因型对愈伤组织GUS瞬时表达的影响  52
    3.4.3 不同状态愈伤组织对GUS瞬时表达的影响  52-54
    3.4.4 不同预培养时间对愈伤组织GUS瞬时表达的影响  54
    3.4.5 不同化学诱导预处理对愈伤组织GUS瞬时表达的影响  54-55
    3.4.6 不同菌株类型对愈伤组织GUS瞬时表达的影响  55
    3.4.7 不同菌液浓度对愈伤组织GUS瞬时表达的影响  55
    3.4.8 不同侵染液对愈伤组织GUS瞬时表达的影响  55
    3.4.9 不同侵染时间对愈伤组织GUS瞬时表达的影响  55-56
    3.4.10 不同共培养时间对愈伤组织GUS瞬时表达的影响  56
    3.4.11 不同共培养温度对愈伤组织GUS瞬时表达的影响  56
  3.5 讨论  56-60
    3.5.1 抗生素种类和浓度的选择  56
    3.5.2 基因型对遗传转化的影响  56-57
    3.5.3 愈伤组织状态对遗传转化的影响  57
    3.5.4 预培养对遗传转化的影响  57
    3.5.5 外植体预处理对遗传转化的影响  57-58
    3.5.6 农杆菌菌株侵染能力的差异  58
    3.5.7 农杆菌菌液浓度和侵染时间对遗传转化的影响  58
    3.5.8 共培养对遗传转化的影响  58-60
4 农杆菌介导甘蔗心叶遗传转化技术研究  60-67
  4.1 材料  60
    4.1.1 甘蔗品种  60
    4.1.2 转化受体  60
    4.1.3 工程菌株与质粒  60
    4.1.4 生化试剂  60
    4.1.5 主要仪器  60
  4.2 培养基  60
  4.3 方法  60-62
    4.3.1 甘蔗心叶G418筛选浓度的确定  60-61
    4.3.2 农杆菌介导的甘蔗心叶遗传转化实验设计  61
      4.3.2.1 甘蔗心叶预处理  61
      4.3.2.2 菌株的培养  61
      4.3.2.3 侵染  61
      4.3.2.4 筛选培养  61
    4.3.3 心叶GUS瞬时表达率分析  61-62
      4.3.3.1 GUS染色液的配制  61
      4.3.3.2 心叶GUS瞬时表达率分析  61-62
  4.4 结果与分析  62-65
    4.4.1 甘蔗心叶G418筛选浓度的确定  62-63
    4.4.2 不同基因型对心叶GUS瞬时表达的影响  63-65
    4.4.3 不同预处理对心叶GUS瞬时表达的影响  65
  4.5 讨论  65-67
    4.5.1 G418筛选浓度对心叶存活率的影响  65-66
    4.5.2 基因型和外植体类型对遗传转化的影响  66-67
5 农杆菌介导甘蔗悬浮细胞遗传转化技术研究  67-75
  5.1 甘蔗悬浮细胞系的建立  67-69
    5.1.1 材料  67-68
      5.1.1.1 甘蔗品种  67
      5.1.1.2 培养基  67-68
    5.1.2 方法  68-69
      5.1.2.1 甘蔗愈伤组织的诱导  68
      5.1.2.2 甘蔗悬浮细胞的培养  68-69
        5.1.2.2.1 悬浮培养基的优化  68-69
        5.1.2.2.2 悬浮培养过程中生长曲线的测定  69
  5.2 头孢霉素和Timent in的液体抑菌试验  69
  5.3 农杆菌介导甘蔗悬浮细胞的遗传转化  69-70
    5.3.1 培养基  69
    5.3.2 农杆菌工程菌株  69
    5.3.3 受体悬浮细胞的制备  69-70
    5.3.4 工程菌的培养  70
    5.3.5 侵染  70
    5.3.6 共培养  70
    5.3.7 筛选培养  70
  5.4 悬浮细胞GUS瞬时表达  70-71
    5.4.1 GUS染色液的配制  70
    5.4.2 悬浮细胞GUS瞬时表达率分析  70-71
  5.5 结果与分析  71-74
    5.5.1 悬浮培养基的优化  71-72
    5.5.2 悬浮细胞生长曲线的测定  72
    5.5.3 头孢霉素和Timentin对农杆菌的抑制效果比较  72-73
    5.5.4 不同菌液浓度和侵染时间对GUS瞬时表达的影响  73-74
  5.6 讨论  74-75
    5.6.1 甘蔗悬浮细胞系的建立  74-75
    5.6.2 甘蔗悬浮细胞与愈伤组织和心叶GUS瞬时表达的比较  75
6 讨论  75-76
7 结论  76-78
参考文献  78-86
致谢  86

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 糖料作物 > 甘蔗
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