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青蒿花药培养体系的建立与优化

作　者: 吴韶龑
导　师: 唐克轩
学　校: 上海交通大学
专　业: 植物学
关键词: 青蒿花药培养体系优化愈伤组织
分类号: S567.219
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

青蒿(Artemisia annua L.)为菊科蒿属一年生草本植物,历代用于中药而被众多医药典籍所收录。青蒿素是从青蒿植株地上部分提取的一种含有过氧桥结构的倍半帖内酯化合物,是目前最有效的抗疟药物,市场需求量巨大。由于青蒿中青蒿素的含量很低,生产成本很高,很多种植者因此丧失市场信心而放弃种植,最终导致青蒿素在实际应用中供不应求的局面。因此,世界上很多国家都致力于青蒿素含量高、农艺性状优良的青蒿品种的培育工作,并取得了一定成果。然而,由于青蒿的自交不亲和性,所发现和培育的优良青蒿植株很难通过传统育种中的自交育种手段稳定遗传。花药培养是上个世纪60年代发源于印度的一种育种手段。将花药分离后并将之在体外的人工培养基上进行培养可以得到单倍性的再生植株。若通过秋水仙素等染色体加倍剂对单倍性植株进行人工加倍后便可以得到遗传背景单一的、在后代中性状不会发生分离的纯合株系。因此,花药培养对于青蒿而言,可以有助于培育青蒿素含量高、农艺性状优良的纯合品系,并最终有利于青蒿素产业的发展和疟疾问题的解决。到目前为止,关于青蒿花药培养体系以及青蒿单倍体育种方面的报道还非常少。本研究的目的是探索建立青蒿的花药培养体系,并摸索较佳的体系条件。本研究对花蕾期青蒿的小孢子发育时期进行了鉴定,在体外分离花药并接种培养,直至培育出再生青蒿植株。同时,本研究利用流式细胞术对再生的青蒿花培植株进行了倍性鉴定。本研究得到了如下结果:1)通过解剖和镜检,确定了青蒿的小孢子发育时期。2)通过愈伤组织诱导实验,确定了青蒿单核期小孢子雄核发育途径的可诱导性,并筛选出了较优的愈伤组织诱导培养基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA)。3)通过愈伤组织分化实验,筛选出了较优的愈伤组织分化培养基(MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA)。4)通过生根培养实验,筛选出了较优的生根培养基(1/2MS +0.5 mg/L NAA)。5)通过设置花药接种后暗培养和见光培养的时间梯度,确定暗培养时间以20-30d为较佳,见光培养以7-10d为较佳。6)对接种材料进行了低温预处理,发现低温预处理对提高愈伤组织诱导率和分化率无明显效果。7)对筛选出的各种优化条件进行了组合,构建了较优化的青蒿花药培养体系,并进行了验证。8)采用流式细胞术对再生青蒿花培植株进行了倍性鉴定,在23株再生青蒿植株中,单倍体、二倍体、三倍体和混倍体植株分别为3、11、3和6株,在整个再生花培植株群体中所占的的比例分别为13.0%、47.9%、13.0%和26.1%。本研究建立了较完整的青蒿花药培养体系,并在此基础上对培养体系进行了优化,为今后开展青蒿单倍体育种等研究工作奠定了基础。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-14
图表目录  14-15
英文缩略词表  15-16
第一章绪论  16-31
  1.1 青蒿概况  16-22
    1.1.1 青蒿简介  16
    1.1.2 青蒿的生物学特征  16-17
    1.1.3 青蒿的药用价值  17-18
    1.1.4 青蒿的分布及种质资源状况  18
    1.1.5 青蒿的研究现状  18-22
  1.2 植物花药培养概述  22-27
    1.2.1 植物花药培养机理  22-25
    1.2.2 影响植物花药培养的因素  25-27
  1.3 青蒿花药培养的意义  27-28
  1.4 本研究的目的和主要内容  28-31
    1.4.1 本研究的目的  28-29
    1.4.2 本研究的主要内容  29-31
第二章材料与方法  31-42
  2.1 材料与试剂  31-32
    2.1.1 植物材料  31
    2.1.2 主要实验仪器设备  31
    2.1.3 主要生化试剂以及植物生长调节剂  31-32
  2.2 实验方法  32-42
    2.2.1 培养基的制备  32-33
    2.2.2 青蒿小孢子发育时期的鉴定和花蕾外观形态的观察  33-34
    2.2.3 青蒿花药愈伤组织诱导  34-36
    2.2.4 青蒿花药愈伤组织分化  36-38
    2.2.5 生根壮苗  38-39
    2.2.6 青蒿花药培养体系的改进和优化  39
    2.2.7 流式细胞术鉴定再生青蒿植株倍性  39-42
第三章结果与分析  42-54
  3.1 青蒿小孢子发育时期的鉴定  42-45
  3.2 青蒿花药培养愈伤组织诱导  45-46
  3.3 青蒿花药培养愈伤组织分化  46-48
  3.4 青蒿花药培养生根  48-50
  3.5 流式细胞术鉴定再生青蒿花培植株倍性  50-51
  3.6 优化后花药培养体系有效性的验证  51-52
  3.7 青蒿花药培养过程中产生的问题苗  52-54
第四章结论与讨论  54-65
  4.1 青蒿花药培养过程中污染的控制  54-55
  4.2 培养基及其添加物对青蒿花药培养的影响  55-58
    4.2.1 基本培养基  55-56
    4.2.2 碳源  56
    4.2.3 植物生长调节剂  56-57
    4.2.4 活性炭及其他添加物  57-58
  4.3 影响青蒿花药培养的其他因素  58-62
    4.3.1 预处理  58-59
    4.3.2 温度  59-60
    4.3.3 光照  60-61
    4.3.4 基因型  61
    4.3.5 小孢子发育时期  61-62
  4.4 青蒿花药培养中出现的其他问题及应对措施  62-65
    4.4.1 玻璃化苗的成因及控制措施  62-63
    4.4.2 愈伤组织褐化的成因及控制措施  63
    4.4.3 青蒿花药培养中的“一步成苗”现象  63-65
第五章总结与展望  65-68
  5.1 工作总结  65-66
  5.2 本研究的创新点  66
  5.3 研究展望  66-68
参考文献  68-78
致谢  78-80
攻读学位期间发表的学术论文  80-81
攻读学位期间申请的发明专利  81-83

青蒿花药培养体系的建立与优化

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