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解淀粉芽孢杆菌41B-1、铜绿假单胞菌841P-3对棉花根围土壤微生物群落结构的影响

作　者: 李芮
导　师: 赵明文
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb) 解淀粉芽孢杆菌41B-1R 铜绿假单胞菌841P-3R 生物防治微生物群落结构 DGGE
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

黄萎病是由土传病原真菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)所引起的一种病害,并且是一种引起很多作物严重经济损失的重要病害。由于大丽轮枝菌具有宿主范围广、能够产生微菌核等特点,所以对其防治比较困难。实际应用中,黄萎病的防治一般使用化学制剂,但是化学制剂会造成严重的环境污染。随着人们对环境问题的逐渐重视,可以替代化学制剂的生防制剂逐渐被应用。在前期研究中,本课题组从棉花植株内分离得到的解淀粉芽孢杆菌41B-1和铜绿假单胞菌841P-3对大丽轮枝菌具有显著的抑制作用。本实验通过筛选这两种生防菌的利福平抗性突变体即41B-1R和841P-3R,用作进一步实验研究。解淀粉芽孢杆菌41B-1R和铜绿假单胞菌841P-3R能够在小麦、玉米、大豆和水稻的根内定殖,且41B-1R比841P-3R具有更稳定的定殖能力。但是,41B-1R、841P-3R在不同的农作物中定殖能力有所不同。在温室实验中,通过接种病原菌V107以及41B-1R或841P-3R到棉花根围土壤中,进而研究土壤微生物群落结构的变化、生防菌41B-1R和841P-3R的定殖能力及生防效果。本实验将平板分离法与PCR-DGGE相结合来考察棉花根围土壤中微生物群落数量和结构的变化。利福平抗性平板分离实验发现：41B-1R和841P-3R能够在土壤和棉花根内定殖,且随着时间增长其定殖数量都有所下降,但41B-1R定殖数量下降幅度较小。与在其他作物中一样,在土壤及棉花根内41B-1R比841P-3R具有更强的定殖能力。平板分离实验结果表明：假单胞菌841P-3R以及病原菌V107在短时间内减少了棉花根围土壤中可培养细菌的数量,但增加了可培养真菌数量且作用时间较长；然而芽孢杆菌41B-1R对于可培养细菌和真菌的影响并不显著。生防菌与病原菌处理对可培养细菌和真菌的影响随着时间的变化最终基本消失。细菌DGGE图谱表明：处理后一周,病原菌V107显著地影响了细菌群落结构,在此基础上接种841P-3R时这种效应会有所减弱,但接种41B-1R这种效应并没有减弱；而处理后三周,这些处理对细菌群落结构都没有显著影响。真菌DGGE图谱表明：处理后一周,存在V107并接种41B-1R或841P-3R对真菌群落的影响与单独接种V107相似,这种现象与对细菌群落结构的影响是相反的。然而处理后五周,这两个处理相对于单独接种V107对真菌群落的影响更显著。生防菌41B-1R或841P-3R与V107分别对芽孢杆菌群落结构以及假单胞菌群落结构的影响与对细菌群落结构影响较为相似。温室实验中对黄萎病的发病情况进行了统计,发现生防菌41B-1R和841P-3R都具有显著的防效。并且通过荧光定量PCR测定土壤中的大丽轮枝菌含量表明：生防菌41B-1R和841P-3R都能够显著减少棉花根围土壤中大丽轮枝菌的含量,这与生防菌的生防效果相一致。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章文献综述  11-19
  1.1 棉花黄萎病简介  11-12
    1.1.1 大丽轮枝菌  11
    1.1.2 棉花黄萎病的传播、危害以及防治  11-12
  1.2 生防菌的研究  12-14
    1.2.1 生防菌的应用  12-13
    1.2.2 生防菌的定殖能力以及对土壤微生态的影响  13-14
  1.3 土壤微生态研究方法与进展  14-17
    1.3.1 主要应用方法简介以及优缺点  14-17
  1.4 论文研究目的、意义以及技术路线  17-19
第二章生防菌41B-1R、841P-3R在农作物中的定殖能力测定  19-27
  2.1 材料  19-20
    2.1.1 生防菌株  19
    2.1.2 病原菌株  19
    2.1.3 植物材料  19-20
    2.1.4 主要培养基、试剂和仪器  20
  2.2 实验方法  20-22
    2.2.1 筛选具有利福平抗性的解淀粉芽孢杆菌41B-1R和铜绿假单胞菌841P-3R  20-22
    2.2.2 数据统计分析  22
  2.3 结果  22-25
    2.3.1 筛选具有利福平抗性的解淀粉芽孢杆菌41B-1R和铜绿假单胞菌841P-3R  22
    2.3.2 抗性菌株体外抑菌试验  22-23
    2.3.3 原始菌株以及突变菌株对棉花生长的影响  23
    2.3.4 生防菌41B-1R、841P-3R在小麦、玉米、大豆以及水稻根内的定殖  23-25
  2.4 讨论  25-27
第三章生防菌41B-1R、841P-3R定殖动态以及对棉花根围土壤细菌、真菌数量的影响  27-35
  3.1 材料  27-28
    3.1.1 生防菌  27
    3.1.2 棉花品种  27
    3.1.3 病原菌  27
    3.1.4 主要培养基、试剂和仪器  27-28
  3.2 实验方法  28-30
    3.2.1 土样  28
    3.2.2 实验设计  28
    3.2.3 取样  28-29
    3.2.4 土壤中及棉花根内41B-1R、841P-3R的动态变化  29
    3.2.5 土壤中可培养细菌、真菌数量的测定  29-30
  3.3 结果  30-32
    3.3.1 生防菌41B-1R、841P-3R在棉花根围土壤中的动态变化  30-31
    3.3.2 生防菌41B-1R、841P-3R在棉花根内的动态变化  31
    3.3.3 生防菌41B-1R、841P-3R与病原菌V107对土壤中可培养细菌数量的影响  31-32
    3.3.4 生防菌41B-1R、841P-3R与病原菌V107对土壤中可培养真菌数量的影响  32
  3.4 讨论  32-35
第四章生防菌41B-1R、841P-3R与病原菌V107对棉花根围土壤微生物群落结构的影响  35-55
  4.1 材料  35
    4.1.1 土壤样品  35
    4.1.2 主要试剂和仪器  35
  4.2 方法  35-39
    4.2.1 溶液配制  35
    4.2.2 土壤总DNA提取及纯化  35-36
    4.2.3 日标片段PCR扩增  36-37
    4.2.4 PCR产物电泳验证  37
    4.2.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)  37-38
    4.2.6 DGGE条带回收  38-39
  4.3 结果  39-52
    4.3.1 纯化后土壤总DNA电泳检测结果  39
    4.3.2 PCR扩增  39-41
    4.3.3 生防菌41B-3R、841P-1R与病原菌V107对棉花根围土壤细菌群落结构的影响  41-44
    4.3.4 生防菌41B-3R、841P-1R与病原菌V107对棉花根围土壤中芽孢杆菌以及假单胞菌群落结构的影响  44-48
    4.3.5 生防菌41B-3R、841P-1R与病原菌V107对棉花根围土壤中真菌群落结构的影响  48-51
    4.3.6 DGGE图谱中变化及优势条带分析  51-52
  4.4 讨论  52-55
第五章棉花根围土壤中大丽轮枝菌含量变化以及温室实验病害统计  55-61
  5.1 材料  55
    5.1.1 主要的仪器  55
  5.2 方法  55-58
    5.2.1 土壤总DNA提取以及纯化  55
    5.2.2 荧光定量PCR  55-56
    5.2.3 应用SYBR Green法进行绝对定量测定土壤中大丽轮枝菌含量  56-57
    5.2.4 黄萎病病害统计  57
    5.2.5 数据统计分析  57-58
  5.3 结果  58-59
    5.3.1 标准曲线  58
    5.3.2 上壤中大丽轮枝菌含量的测定  58-59
    5.3.3 黄萎病病害统计  59
  5.4 讨论  59-61
全文总结  61-63
参考文献  63-71
致谢  71

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