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杂交竹梢枯病菌蛋白毒素及其精确作用机制研究

作　者: 李姝江
导　师: 朱天辉
学　校: 四川农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 杂交竹梢枯病菌蛋白毒素作用机制
分类号: S763.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

暗孢节菱孢菌是引起四川栽培区杂交竹梢枯病的新病原,其致病机理研究不深入,特别在该菌蛋白毒素方面的研究尚为空白。本论文以该病原为对象,在研究其蛋白毒素诱导因子基础上,对蛋白毒素进行分离纯化、组分和分子结构、基本性质的分析,探索蛋白毒素对杂交竹生理代谢影响规律,弄清其作用浓度临界值,比较病菌与蛋白毒素对杂交竹伤害的生理学差异；并通过毒素免疫化学方法标记分析蛋白毒素结合位点和探索蛋白毒素对杂交竹嫩枝离体线粒体生物物理特性及呼吸作用的影响。获得以下主要研究结果：1.在采用单因素筛选最佳培养基及其成分的基础上,运用正交试验确定诱导暗孢节菱孢产蛋白毒素的温度、时间、pH、光照、瓶装量、接种量六个因素,从而得出最优诱导方案为：在改良Fries培养基+杂交竹煎汁为基础培养基中,乳糖等量代替葡萄糖；温度25℃,pH7,黑暗条件下,1块菌丝块（5mm）接种于80mL培养液（300mL三角瓶）振荡培养15d。在此诱导方案下,梢枯病菌产毒能力显著提高,杂交竹嫩枝感病指数在96h时高达85.69%。2.采用硫酸铵分级沉淀法对暗孢节菱孢的发酵上清液进行盐析,生测结果显示上清液没有活性,沉淀有活性,其盐析的最适饱和度为50%。此粗提物经SephadexG-50分子筛层析、High Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析和Sephadex G-75分子筛层析后获得1个活性峰,SDS-PAGE电泳检测该峰为单一条带,以相对迁移率（mR）算得该蛋白的分子量为34.5kDa。将该峰进一步用RP-HPLC的方法进行纯度检验,经洗脱后得到2个峰,活性检测表明出峰时间为21min的峰2具有致萎活性,并命名为AP-toxin。采用Edman降解法成功测定了AP-toxin的N端13个氨基酸序列,即H2N-Pro-Pro-Ser-Gln-Val-Gln-Arg-Ala-Pro-Glu-Leu-Thr-Ser。经NCBI蛋白质数据库比对分析,推断该蛋白毒素与Phytophthora sojae的hypothetical protein PHYSODRAFT₅63177氨基酸残基序列100%同源。对AP-toxin’性质研究的结果表明,该毒素耐温度范围为0-80℃、耐酸碱的范围为pH4-10、耐白炽光却不耐紫外线照射,对蛋白酶K和胰蛋白酶具有较好的耐受性,有一定专化性、介于专化性与非专化性毒素之间。3.采用针刺法对AP-toxin进行田间致病力检测,结果显示不同浓度AP-toxin处理的杂交竹针刺处均出现不同大小的褐色菱形病斑,与用A.phaeospermum菌悬液处理的一致,但反应快于病原菌；40、80μg/mL AP-toxin处理从15d开始与A.phaeospermum菌悬液处理的差异不显著。在不同杂交竹品种中,AP-toxin有效起始作用浓度不同：对抗病品种（3号和6号杂交竹）的有效起始作用浓度为10-20μg/mL；对感病品种（8号和30号杂交竹）的有效起始作用浓度为5-10μg/mL。4.采用浸渍法测定AP-toxin对4个杂交竹品种生理代谢的影响。毒素处理后,酚代谢的总酚和类黄酮含量先上升后下降,大小顺序均为6#>3#>30#>8#；核酸代谢中的总核酸、DNA、RNA含量均下降且DNase和RNase活性增加,但抗病品种中二者的降幅和增幅小于感病品种；蛋白质代谢中的可溶性蛋白含量先上升后下降,抗病品种增幅明显大于感病品种,4个品种蛋白酶活性均升高；糖代谢中4个品种可溶性糖含量均呈显著下降趋势,但6#>3#>30#>8#,但还原糖含量变化规律相反,均不同程度升高,且大小顺序为8#>30#>3#>6#。同时,测定了毒素对杂交竹防御酶系（POX、 SOD、PAL、PPO、几丁质酶、p-1,3葡聚糖酶）活性的影响,抗病品种的POX活性先升高到峰值然后下降后又上升,后期趋于稳定；感病品种均显著下降。SOD、PAL活性动态变化的规律均为初期升高而后期下降的趋势,大小顺序为6#>3#>30#>8#。抗病品种PPO活性0-72h大幅增加,之后下降保持一定水平；感病品种在36h时达到峰值,随即下降,在96h已低于无菌水对照组。4个品种几丁质酶活性均在0-36h内显著升高,但感病品种和抗病品种间差异显著。抗病品种p-1,3葡聚糖酶活性在0-240h内该酶活性迅速升高,至240h均达到峰值,之后有所下降但始终高于初始阶段；感病品种在整个测试期内其酶活均缓慢下降,但8号下降趋势更为明显。5.结合AP-toxin处理后杂交竹的症状表现及感病指数,以及AP-toxin伤害与杂交竹生理代谢的相关性分析,结果显示,总酚和类黄酮含量与抗性显著相关,而与感病指数显著负相关,但类黄酮含量与时间不相关；核酸代谢的五项指标与时间和抗性均显著相关,总核酸含量和RNA含量与感病指数呈显著负相关；蛋白质代谢中的蛋白酶活性与感病指数相关性不显著外,其余均达到显著水平；可溶性糖含量与时间、抗性、感病指数相关性达到极显著水平,而还原糖除与抗性极显著负相关外,与时间和感病指数相关性不显著。在6种防御酶活性中,与抗性呈显著或极显著正相关,而与感病指数呈负相关,但仅POX和β-1,3葡聚糖酶与时间显著正相关。另外,感病指数与时间呈极显著正相关,与品种抗性之间为极显著负相关。6.以AP-toxin免疫新西兰白兔制备毒素特异性抗血清,并将该蛋白用不同浓度的抗体吸附后处理杂交竹幼嫩枝条。结果表明,毒素所引起的症状有不同程度的减轻,说明所制备的抗体在与毒素发生特异性免疫学反应的同时,可部分封闭毒素分子上与毒素受体结合的位点;利用竞争酶联免疫吸附试验（ELISA）测定杂交竹嫩枝的质膜制剂与毒素蛋白的结合活性显示,质膜制剂与毒素结合后能部分阻断毒素与其抗体的免疫学反应,即质膜制剂中含有毒素的结合位点,且不同品种的结合活性有差异；胰蛋白酶和加热处理质膜制剂后,质膜制剂对毒素与其抗体反应的抑制作用消失,证实质膜制剂中与毒素结合的是蛋白类物质。7.采用不同检测技术（如荧光偏振法、中性红法、氧电极法等）测定AP-toxin对杂交竹嫩枝线粒体膜的流动性、表面电位、肿胀度、聚集度及脂质过氧化物MDA、 H2O2、辅酶Q10（COQ1O）含量、线粒体呼吸功能的影响。结果表明,蛋白毒素胁迫使线粒体膜流动性减弱、表面电位减低、肿胀度增大、聚集度降低；CoQ10含量下降,H2O2、MDA含量的增加,细胞色素C氧化酶（CCO）、ATPase活性亦下降,呼吸控制率（RCR）和磷氧比（P/O）明显降低,说明蛋白毒素对杂交竹嫩枝线粒体膜造成损伤,线粒体脂质过氧化程度增加,膜完整性被破坏,呼吸作用受抑制。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-14
第一章竹梢枯病及病原真菌致病毒素研究进展  14-37
  1 文献综述  14-33
    1.1 竹梢枯病研究进展  14-19
    1.2 植物病原真菌致病毒素研究进展  19-33
  2 研究目的与意义  33-34
  3 研究内容  34-36
  4 技术路线  36-37
第二章杂交竹梢枯病菌产毒诱导因子研究  37-54
  1 材料与方法  37-42
    1.1 供试材料  37-38
    1.2 培养滤液的制备  38
    1.3 培养基的筛选  38-39
    1.4 产毒诱导条件优化  39-41
    1.5 生物测定  41-42
    1.6 数据分析  42
  2 结果与分析  42-51
    2.1 产毒培养基的确定  42-48
    2.2 产毒诱导条件的正交试验  48-51
    2.3 最优诱导条件下的梢枯病菌产毒能力  51
  3 结论与讨论  51-54
    3.1 优化方法的选择是诱导杂交竹梢枯病菌产毒的基础  51-52
    3.2 培养条件是诱导杂交竹梢枯病菌产毒的关键  52-54
第三章杂交竹梢枯病菌蛋白毒素纯化及其基本性质研究  54-78
  1 材料与方法  55-62
    1.1 供试材料  55
    1.2 毒素致病组分的确定  55-56
    1.3 毒素粗提的透析与浓缩  56
    1.4 毒素的分离纯化及序列测定  56-60
    1.5 纯毒素基本性质的研究  60-61
    1.6 毒素致病力测定  61-62
    1.7 数据分析  62
  2 结果与分析  62-74
    2.1 粗毒素致病成分和硫酸铵最适饱和度  62-63
    2.2 蛋白毒素的分离纯化及其N端氨基酸序列  63-70
    2.3 蛋白毒素AP-toxin基本性质的测定  70-73
    2.4 蛋白毒素AP-toxin致病力的测定  73-74
  3 结论与讨论  74-78
    3.1 合理纯化和鉴定方法对获得高纯度蛋白质及探索其结构至关重要  74-75
    3.2 蛋白毒素AP-toxin是暗孢节菱孢菌的主要致病因子  75-76
    3.3 蛋白毒素AP-toxin的基本性质是进一步深入研究致病机制的基础  76-78
第四章梢枯病菌蛋白毒素对不同杂交竹品种生理代谢的影响  78-106
  1 材料与方法  79-83
    1.1 供试材料  79
    1.2 蛋白毒素对不同杂交竹品种的有效起始作用浓度测定  79
    1.3 蛋白毒素对不同杂交竹品种代谢的影响  79-82
    1.4 蛋白毒素对杂交竹防御酶系的影响  82-83
    1.5 蛋白毒素伤害与杂交竹生理代谢相关性分析  83
    1.6 数据分析  83
  2 结果与分析  83-101
    2.1 蛋白毒素AP-toxin对不同杂交竹品种的有效起始作用浓度  83-85
    2.2 蛋白毒素AP-toxin对不同杂交竹品种代谢的影响  85-93
    2.3 蛋白毒素AP-toxin对不同杂交竹品种防御酶系的影响  93-98
    2.4 蛋白毒素AP-toxin伤害与杂交竹生理代谢相关性  98-101
  3 结论与讨论  101-106
    3.1 不同杂交竹品种对蛋白毒素有效起始浓度的响应具有差异  101-102
    3.2 不同杂交竹品种对蛋白毒素生理响应不同  102-104
    3.3 蛋白毒素可作为杂交竹抗病品种的选择压力  104-106
第五章蛋白毒素精确结合位点及对杂交竹线粒体生物物理特性与呼吸作用的影响  106-128
  1 材料与方法  107-111
    1.1 供试材料  107
    1.2 蛋白毒素的质膜结合位点研究  107-109
    1.3 蛋白毒素对线粒体生物物理特性的影响  109-110
    1.4 蛋白毒素对线粒体呼吸作用的影响  110-111
    1.5 数据分析  111
  2 结果与分析  111-124
    2.1 蛋白毒素的质膜结合位点  111-115
    2.2蛋白毒素对线粒体生物物理特性的影响  115-120
    2.3 蛋白毒素对线粒体呼吸作用的影响  120-124
  3 结论与讨论  124-128
    3.1 杂交竹细胞质膜是蛋白毒素AP-toxin的作用结合位点  124-125
    3.2 蛋白毒素AP-toxin对杂交竹线粒体特性及功能影响显著  125-128
第六章小结、创新点及展望  128-132
  1 小结  128-130
  2 创新点  130
  3 展望  130-132
参考文献  132-148
攻读学位期间发表的学术论文及获奖成果  148-150
致谢  150

杂交竹梢枯病菌蛋白毒素及其精确作用机制研究

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