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10-HDA对G~+抑菌活性及机制的研究

作　者: 李俊霖
导　师: 王瑞明
学　校:
专　业: 发酵工程
关键词: 10-羟基-2-癸烯酸抑菌机理细胞膜基因组
分类号: TS218
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）是蜂王浆的标志性物质，大约占蜂王浆的1.4%~2.0%，其结构式为HO-CH2-(CH2)6-CH=CH-COOH(C10H18O3)。10-HDA具有抑菌、提高免疫力、抗辐射和降血脂等多种功效。虽然10-HDA对细菌具有良好的抑制效果，但对其抑菌机理却是知之甚少。因此，本论文以金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为实验菌株，主要从细胞生物学、生物化学和分子生物学等方面入手，对10-HDA的抑菌机理进行较为系统的研究。取得的结果如下：1、10-HDA生物活性的确定为了确定与分析10-HDA的抑菌性能，采用牛津杯法，倍半稀释法进行抑菌性能测定实验。结果表明，10-HDA对多种病原细菌具有明显的抑制作用，表现出广谱抗菌活性，且抑菌效果随着10-HDA浓度的增加显著提高。其中，对金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）均为0.62mg/mL。2、10-HDA对金黄色葡萄球菌细胞膜及代谢活力的影响通过对金黄色葡萄球菌生长曲线、细胞膜通透性、细胞代谢活力等方面的研究，探讨10-HDA对金黄色葡萄球菌细胞膜的作用机理。结果表明10-HDA可以破坏金黄色葡萄球菌细胞的完整性，促使细胞膜通透性增加，使得胞内大量离子以及具有紫外吸收的大分子物质泄漏，细胞代谢发生紊乱。3、10-HDA对枯草芽孢杆菌基因组DNA及蛋白合成的影响以枯草芽孢杆菌为供试菌，采用凝胶阻滞实验及原子力显微镜观察10-HDA与菌体DNA结合情况，并采用DNA琼脂糖凝胶电泳观察10-HDA作用后菌体DNA含量的变化，以及10-HDA对菌体基因组PCR的影响。结果显示，当10-HDA浓度达到0.62mg/mL时，菌体中基因组DNA的合成量明显减少，而且10-HDA与细菌基因组DNA紧密结合。对基因组DNA的PCR影响实验进一步证明，当PCR体系中10-HDA的浓度达到1.0mg/mL时，DNA的合成被完全阻碍。综上所述，通过实验，我们初步推断10-HDA对G+菌的抑菌机理是：10-HDA通过改变膜蛋白构象，破坏细胞膜，导致大量物质外泄，使细胞代谢发生紊乱，进入菌体后与基因组DNA结合，抑制DNA的复制及转录，菌体生长受到抑制，并最终导致菌体死亡。

全文目录

摘要  10-11
ABSTRACT  11-13
第1章绪论  13-29
  1.1 蜂王浆研究进展及独特活性  13-16
    1.1.1 蜂王浆简介  13-14
    1.1.2 蜂王浆的独特活性  14-16
    1.1.3 蜂王浆的抗菌成分及研究现状  16
  1.2 10-HDA 概述及药理作用研究  16-19
    1.2.1 10-HDA 简介  16-17
    1.2.2 10-HDA 的合成方法  17-18
    1.2.3 10-HDA 药理作用研究  18-19
  1.3 抗菌药物的研究进展  19
  1.4 抑菌机制研究概述  19-24
    1.4.1 对细菌细胞壁的作用  20
    1.4.2 对细菌细胞膜渗透性的影响  20-21
    1.4.3 对细菌基因组 DNA、RNA 的作用  21
    1.4.4 对细菌蛋白质的作用  21-22
    1.4.5 对细菌呼吸代谢的作用  22-23
    1.4.6 对细菌生长曲线的作用  23
    1.4.7 对细菌细胞分裂周期的影响  23
    1.4.8 对细菌形态的作用  23
    1.4.9 对细菌结构的作用  23-24
  1.5 金黄色葡萄球菌的研究现状与食品安全  24-25
    1.5.1 金黄色葡萄球菌的研究现状  24-25
      1.5.1.1 金黄色葡萄球菌的生物学特点  24
      1.5.1.2 黄色葡萄球菌的抵抗力  24
      1.5.1.3 金黄色葡萄球菌的致病性  24-25
    1.5.2 金黄色葡萄球菌与食品安全  25
  1.6 枯草芽孢杆菌概述  25-26
  1.7 本课题的立题背景和研究内容  26-29
    1.7.1 立题背景  26
    1.7.2 研究内容  26-29
第2章 10-HDA 生物活性的研究  29-37
  2.1 实验材料  29-30
    2.1.1 实验菌株  29
    2.1.2 实验原料  29-30
    2.1.3 试剂及药品  30
    2.1.4 仪器及设备  30
  2.2 实验方法  30-32
    2.2.1 菌株的活化与分离纯化  30-31
      2.2.1.1 细菌培养方法  30-31
      2.2.1.2 真菌培养方法  31
    2.2.2 抑菌性能的测定  31
    2.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定  31-32
    2.2.4 对细菌生长曲线的影响  32
    2.2.5 10-HDA 抗菌稳定性检测  32
  2.3 结果与讨论  32-36
    2.3.1 10-HDA 抑菌性能测定结果  32-33
    2.3.2 最小抑菌浓度（MIC）的测定结果  33-34
    2.3.3 对细菌生长曲线的影响  34-35
    2.3.4 10-HDA 抗菌稳定性检测  35-36
  2.4 本章小结  36-37
第3章 10-HDA 对细菌细胞膜以及代谢活力作用机制的研究  37-49
  3.1 实验材料  37-39
    3.1.1 实验菌株  37-38
    3.1.2 实验原料  38
    3.1.3 试剂及药品  38
    3.1.4 仪器及设备  38-39
  3.2 实验方法  39-41
    3.2.1 菌株的活化与分离纯化  39
      3.2.1.1 细菌培养方法  39
    3.2.2 对菌体细胞膜通透性的影响  39
    3.2.3 对菌体核酸类物质泄漏量的影响  39
    3.2.4 荧光分析法测 10-HDA 对菌体膜蛋白构象的影响  39-40
      3.2.4.1 确定 Trp 在金黄色葡萄球菌膜蛋白中的激发波长  39-40
      3.2.4.2 Trp 在金黄色葡萄球菌膜中位置的确定  40
      3.2.4.3 荧光法测 10-HDA 对金黄色葡萄球菌膜蛋白构象的影响  40
    3.2.5 对细胞显微特征的影响  40-41
    3.2.6 对细菌代谢活力的影响  41
  3.3 结果与讨论  41-46
    3.3.1 对菌体细胞膜通透性的影响  41-42
    3.3.2 对菌体核酸类物质泄漏量的影响  42-43
    3.3.3 荧光分析法测 10-HDA 对菌体膜蛋白构象的影响  43-44
    3.3.4 对细胞显微特征的影响  44-46
    3.3.5 对细菌代谢活力的影响  46
  3.4 本章小结  46-49
第4章 10-HDA 对细菌基因组 DNA 及蛋白合成作用机制的研究  49-61
  4.1 实验材料  49-52
    4.1.1 实验菌株  49
    4.1.2 实验原料  49-51
    4.1.3 试剂及药品  51-52
    4.1.4 仪器及设备  52
  4.2 实验方法  52-54
    4.2.1 菌株的活化与分离纯化  52-53
      4.2.1.1 细菌培养方法  52-53
    4.2.2 10-HDA 与细菌 DNA 结合凝胶阻滞实验  53
    4.2.3 原子力显微镜观察 10-HDA 与 DNA 的结合实验  53
    4.2.4 10-HDA 对细菌体内 DNA 含量的影响  53
    4.2.5 10-HDA 对 PCR 反应的影响  53-54
    4.2.6 对细菌蛋白质表达的影响  54
  4.3 结果与讨论  54-59
    4.3.1 10-HDA 与细菌 DNA 结合凝胶阻滞实验  54-55
    4.3.2 原子力显微镜观察 10-HDA 与 DNA 的结合  55-56
    4.3.3 10-HDA 对细菌体内 DNA 合成的影响  56-58
    4.3.4 对细菌蛋白质表达的影响  58-59
  4.4 本章小结  59-61
第5章总结与展望  61-65
  5.1 总结  61-62
  5.2 展望  62-65
参考文献  65-71
致谢  71-73
在学期间主要科研成果  73
  发表学术论文  73

10-HDA对G~+抑菌活性及机制的研究

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