学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

荔枝酸腐菌遗传转化体系的构建

作　者: 谢玲平
导　师: 胡方平
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 荔枝酸腐菌原生质体遗传转化 GFP基因
分类号: S436.67
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 2次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

荔枝酸腐菌是荔枝贮藏期的主要病原菌之一,在我国广东、福建等地均有发生。对于该病原菌的研究目前主要集中在其生长、产孢等影响因子的探讨,对其侵染致病以及与寄主植物之间的互作等分子生物学方面尚未见详细的研究报道。而了解病原菌与寄主的分子作用机理是发展新的防治策略的基础。绿色荧光蛋白基因是目前研究真菌的生态以及病原菌与寄主植物之间互作关系的主要标记基因,为了进一步探讨荔枝酸腐菌与寄主植物之间的互作机理,本研究就该病菌的遗传转化体系进行构建,并获得了一些初步的研究结果。实验结果进一步证明福建荔枝酸腐病的病原菌为Geotrichum candidum,该菌在培养基上的菌落为白色,表面粉状,菌丝无色,有隔膜,2-3次分叉,有内生孢子形成。分生孢子梗短,不分支,分生孢子串生；该菌的生长温度范围18-32℃,大于37℃培养条件下不生长。另外,本实验还系统的探讨了培养基种类、温度、pH值、光照时间以及转速等对该病菌菌丝形成的影响,结果表明,该病菌菌丝生长的最佳条件为pH为6.0的YEPD培养基,温度为30℃,光照为4-12h,转速为180rpm。荔枝酸腐菌原生质体释放和再生的最佳条件：培养基为YEPD培养基,酶组成为5mg·ml-1崩溃酶,酶解时间为4h,酶解温度为30℃,菌龄为2d,再生培养基为以20%蔗糖为渗透压稳定剂的YEPD培养基。最高可得到原生质体产量为58.66×106个.ml-1,再生率为0.155%。本研究构建了两个重组表达质粒pHAMT35G-gfp-Hmb和pHsp-gfp-Hmb,通过PEG介导转化系统成功的将绿色荧光蛋白基因转入荔枝酸腐菌中,转化子在荧光显微镜下可发荧光,通过PCR扩增结果表明绿色荧光蛋白基因成功地整合到该病菌的DNA中；所获得的转化子能稳定遗传,如继代培养7次后,仍能观察到发出绿色荧光的分生孢子和菌丝；另外,转化子的菌落形态、生长速度及其致病性与野生型菌株一致。本实验还就含有不同启动子的表达载体和不同分子量的PEG对荔枝酸腐菌转化率的影响进行研究,结果表明,含有盘梗霉属ham启动子的表达载体pHAMT35G-gfp-Hmb的转化率最高,而单转化的转化率略高于共转化；另外,PEG-MW3350的转化率比PEG-MW4400的转化率高。

全文目录

摘要  9-10
Abstract  10-12
1 前言  12-25
  1.1 荔枝的营养价值及生产现状  12
  1.2 荔枝酸腐病菌的研究概况  12-14
    1.2.1 荔枝酸腐菌的简介  12-13
    1.2.2 荔枝酸腐病防治的研究  13-14
  1.3 丝状真菌遗传转化的研究进展  14-20
    1.3.1 研究概况  14
    1.3.2 选择标记  14-16
      1.3.2.1 营养缺陷型标记  14-15
      1.3.2.2 抗药性标记  15-16
    1.3.3 原生质体的制备与再生  16-18
      1.3.3.1 原生质体的制备  16-17
      1.3.3.2 原生质体的再生  17-18
    1.3.4 原生质体的转化  18-20
      1.3.4.1 CaCl2-PEG转化方法  18-19
      1.3.4.2 电激转化法  19
      1.3.4.3 限制性内切酶介导转化法  19-20
  1.4 GFP基因在真菌中应用的研究进展  20-24
    1.4.1 GFP基因在真菌应用中的特点  21
    1.4.2 GFP随机插入真菌基因组在真菌研究中的应用  21-22
    1.4.3 GFP与目的基因融合在真菌分子生物学研究中的应用  22-24
  1.5 本研究的目的和意义  24-25
2 荔枝酸腐菌菌丝产生条件的筛选  25-33
  2.1 供试材料  25
  2.2 供试培养基  25
  2.3 实验方法  25-26
    2.3.1 培养性状观察  25
    2.3.2 培养基成分对病菌菌丝体生长的影响  25
    2.3.3 温度对病菌菌丝体生长的影响  25-26
    2.3.4 光照时间对病菌菌丝体生长的影响  26
    2.3.5 pH对病菌菌丝体生长的影响  26
    2.3.6 转速对病菌菌丝体生长的影响  26
    2.3.7 培养时间对病菌菌丝体生长的影响  26
  2.4 结果和分析  26-31
    2.4.1 荔枝酸腐菌的形态学特征  26-28
    2.4.2 不同培养基对病菌菌丝体生长的影响  28
    2.4.3 温度对病菌菌丝体生长的影响  28
    2.4.4 光照对病菌菌丝体生长的影响  28-30
    2.4.5 pH对病菌菌丝体生长的影响  30
    2.4.6 转速对病菌菌丝体生长的影响  30-31
    2.4.7 培养时间对病菌菌丝体生长的影响  31
  2.5 小结与讨论  31-33
3. 荔枝酸腐菌原生质体制备和再生条件的筛选  33-46
  3.1 供试材料  33
  3.2 供试培养基  33
  3.3 供试试剂及配置方法  33
  3.4 酶  33
  3.5 实验方法  33-36
    3.5.1 荔枝酸腐菌的培养  33
    3.5.2 荔枝酸腐菌原生质体制备  33-34
    3.5.3 菌丝菌龄对原生质体产量的影响  34
    3.5.4 酶系组成对原生质体产量的影响  34
    3.5.5 崩溃酶浓度对原生质体产量的影响  34
    3.5.6 不同酶解温度对原生质体产量的影响  34
    3.5.7 酶解时间对原生质体产量的影响  34-35
    3.5.8 不同酶解转速对原生质体产量的影响  35
    3.5.9 不同培养基对原生质体产量的影响  35
    3.5.10 原生质体大小及形成方式的观察  35
    3.5.11 渗透压稳定剂对原生质体的损耗率  35
    3.5.12 荔枝酸腐菌原生质体再生  35
    3.5.13 不同菌龄对原生质体再生的影响  35-36
    3.5.14 酶反应时间对原生质体再生的影响  36
    3.5.15 不同再生培养基对原生质体再生的影响  36
    3.5.16 不同的渗透压稳定剂对原生质体再生的影响  36
    3.5.17 原生质体再生的观察  36
  3.6 结果与分析  36-44
    3.6.1. 荔枝酸腐菌原生质体的制备  36-42
      3.6.1.1 菌丝菌龄对原生质体产量的影响  36-37
      3.6.1.2 酶系组成对原生质体产量的影响  37-38
      3.6.1.3 崩溃酶浓度对原生质体产量的影响  38
      3.6.1.4 不同酶解温度对原生质体产量的影响  38
      3.6.1.5 不同酶解时间对原生质体产量的影响  38-39
      3.6.1.6 不同培养基成分对原生质体产量的影响  39
      3.6.1.7 不同转速对原生质体产量的影响  39-41
      3.6.1.8 不同的渗透压稳定剂对原生质体的损耗率  41
      3.6.1.9 原生质体大小及形成方式的观察  41-42
    3.6.2 原生质体再生条件的测定  42-44
      3.6.2.1 不同菌龄对原生质体再生的影响  42
      3.6.2.2 酶反应时间对原生质体再生的影响  42-43
      3.6.2.3 不同再生培养基对原生质体再生的影响  43
      3.6.2.4 渗透压稳定剂种类和浓度对原生质体再生的影响  43
      3.6.2.5 原生质体再生的观察  43-44
  3.7 小结与讨论  44-46
4. GFP基因工程菌株的构建  46-62
  4.1 供试材料  46
  4.2 供试培养基  46
  4.3 供试质粒  46
  4.4 供试药剂及配置方法  46-48
    4.4.1 主要试剂  46-47
    4.4.2 酶  47
    4.4.3 试剂盒  47-48
  4.5 实验方法  48-54
    4.5.1 质粒的提取  48
    4.5.2 从琼脂糖凝胶中回收DNA  48-49
    4.5.3 重组质粒pHAMT35G-gfp-Hmb和pHsp-gfp-Hmb  49-52
      4.5.3.1 质粒HSP-gfp、pHAMT35G-gfp、pCT74和pCX62的提取  49-50
      4.5.3.2 质粒的重组  50
      4.5.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  50
      4.5.3.4 重组质粒的PCR快速鉴定  50-51
      4.5.3.5 重组质粒的酶切鉴定  51-52
    4.5.4 荔枝酸腐菌对潮霉素的敏感性测定  52
    4.5.5 荔枝酸腐菌的转化  52
      4.5.5.1 转化步骤  52
      4.5.5.2 不同PEG对转化率的影响  52
      4.5.5.3 不同质粒的转化率  52
    4.5.6 转化子验证  52-53
      4.5.6.1 转化子的形态特征及选择培养基上的再次筛选  52-53
      4.5.6.2 荔枝酸腐菌转化子DNA的提取  53
      4.5.6.3 转化子的PCR验证  53
    4.5.7 转化子的荧光稳定性和菌丝生长速度  53
    4.5.8 转化子致病性测定及侵染观察  53-54
  4.6 结果与分析  54-59
    4.6.1 重组质粒pHAMT35G-gfp-Hmb和pHsp-gfp-Hmb的构建  54
    4.6.2 野生型菌株对潮霉素的敏感性  54-55
    4.6.3 转化条件的筛选  55-56
      4.6.3.1 不同质粒的转化率  55-56
      4.6.3.2 不同PEG对转化率的影响  56
    4.6.4 转化子的形态特征以及对潮霉素B的抗性水平  56-57
    4.6.5 转化子的GFP基因验证  57-58
      4.6.5.1 转化子的荧光观察  57-58
      4.6.5.2 转化子的PCR鉴定  58
    4.6.6 转化子的荧光稳定性与菌丝生长速度  58-59
    4.6.7 转化子致病性测定及侵染观察  59
  4.7 小结与讨论  59-62
5 结论与讨论  62-63
  5.1 主要研究结果  62
  5.2 特色  62-63
参考文献  63-69
致谢  69

荔枝酸腐菌遗传转化体系的构建

内容摘要

全文目录

相似论文