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梨树主要病害的分子检测及其生物化学协同控制研究

作　者: 张磊
导　师: 常有宏
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 巢式PCR 生物防治 生防菌 复配剂 荧光定量PCR
分类号: S436.612
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


梨黑斑病、梨轮纹病和梨炭疽病是梨树三大主要病害,主要为害果实,叶片,也能侵染枝条。三种病害在我国普遍发生,均曾经大范围流行,造成重大损失。本文以三种病害为研究对象,建立了一套梨轮纹病和炭疽病的分子检测体系；测定了市场上常见化学药剂对三种病害病原菌的室内毒力指数；开展微生物-化学复配药剂田间防治三种病害的试验；荧光定量PCR监测生防菌处理后对梨叶片抗氧化相关基因的表达丰度,以探明生防机理,为三种病害有效控制提供理论和实践依据。主要研究内容如下：采集病样,分离纯化后获得梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)和轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana)菌株各20株,提取菌株基因组DNA。根据Genebank上炭疽属和轮纹属不同小种的ITS序列差异设计两对引物TJ1/TJ2和]LW1/LW2。由此建立的PCR体系可分别从炭疽菌菌株和轮纹菌菌株中扩增出317bp和325bp的特异性条带,对其他相似或相近的病原真菌则无扩增条带,表明设计的两对引物具有较高的种属专化性。本文还比较了常规PCR和巢式PCR技术的灵敏度。常规PCR技术检测梨轮‘纹病菌基因组DNA的灵敏度为10pg,巢式PCR技术的灵敏度为100ag,巢式PCR技术的灵敏度比常规PCR提高了约105倍。将不同稀释倍数(10个/ml、102个/ml、103个/ml、104·个/ml、105·个/ml)的轮纹病菌孢子悬浮液喷施在梨果上,提取梨果实DNA进行巢式PCR检测,均能成功地检测出病原菌。实验结果表明：利用巢式PCR技术,可以准确、灵敏地监测梨轮纹病菌在果园的种群消长动态。选取市场常见的20种化学药剂,对黑斑病菌A-1、梨轮纹病菌P-16、炭疽病菌Ⅰ-1进行室内毒力测定。结果表明,25%丙环唑乳油能有效抑制梨黑斑病菌、轮纹病菌、炭疽病菌菌丝生长,ECso值分别为0.031μg/ml、0.019μg/ml、0.020μg/ml。此外,10%苯醚甲环唑可湿性粉剂、25%咪酰胺乳油、40%氟硅唑乳油,30%己唑醇可湿性粉剂等四种药剂对梨轮纹、黑斑、炭疽病菌均表现出较高毒力,对菌丝的生长抑制作用较强,而50%烯酰吗啉可湿性粉剂、25%甲霜灵可湿性粉剂、15%三唑酮可湿性粉剂等药剂对菌丝的生长抑制作用较弱。本文评估了常见20种化学药剂对梨三大病害的抗药性风险,为果园的合理施药提供参考依据。目前生产上通常采用化学药剂防治上述三大病害。这种化学防治果树病害的方法不仅造成生态环境严重污染,而且直接增加了有毒化学物质在果品中的残留量,对人类健康带来危害。生物防治可以降低化学农药的使用量、降低梨果表面化学杀菌剂的残留量、保护生态环境。本研究利用一株对黑斑病、轮纹病和炭疽病均具有良好防治效果的枯草芽孢杆菌sf-628和25%丙环唑乳油复配(2:1)防治果树病害。田间试验结果显示,复配剂、化学药剂、sf-628对梨轮纹病的平均防治效果分别为86.2%、86.9%、64.9%；对梨炭疽病的平均防治效果分别为80.1%、78.8%、63.0%；对黑斑病的平均防治效果为83.1%、85.8%、77.0%。结果表明,复配药剂与常规使用的化学药剂防效大致相同,但是只使用1/3的化学药剂用量,实现生物农药部分替代化学药剂的作用。本文采用荧光定量PCR分析了喷施生防菌sf-628菌液后对梨叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化氢酶(CAT)基因表达的影响。结果表明：生防菌液处理能诱导梨树产生抗性,提高梨叶片内部PAL和CAT基因表达水平。Real-time PCR分析结果表明：喷施生防菌sf-628菌液24h后,CAT和PAL基因表达丰度最高,分别为对照处理的3.5倍和2.4倍,而后它们的表达量逐渐下降。推测可能与生防菌在叶片的定殖情况相关。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
上篇 文献综述  11-34
  第一章 梨树主要病害研究进展  12-20
    1 梨黑斑病研究现状  12-14
      1.1 病原菌分类  12
      1.2 病害症状  12-13
      1.3 病原真菌生物学特性  13
      1.4 致病条件研究  13-14
    2 梨轮纹病研究现状  14-15
      2.1 病原菌分类  14
      2.2 病害症状  14-15
      2.3 病原菌生物学特性  15
      2.4 致病条件研究  15
    3 梨炭疽病研究现状  15-17
      3.1 病原菌分类  15-16
      3.2 病害症状  16
      3.3 病原菌生物学特性  16
      3.4 致病条件研究  16-17
    4 病害防治  17
    5 展望  17-20
  第二章 真菌病害分子检测方法研究进展  20-28
    1 PCR分子诊断方法  20-25
      1.1 植物病害检测中常用PCR分子标记技术  20-23
      1.2 植物病害检测中新兴PCR分子技术的应用  23-25
    2 分子检测方法存在的优缺点  25-26
      2.1 所需模板量  25
      2.2 重复性  25-26
      2.3 多态性  26
      2.4 可操作性  26
      2.5 其它  26
    3 应用前景展望  26-28
  第三章 植物病害生物防治的研究进展  28-34
    1 生防因子的种类  28-31
      1.1 生防细菌的应用  28-30
      1.2 生防放线菌的应用  30
      1.3 生防真菌的应用  30-31
    2 生防菌控病机理  31-32
      2.1 种群竞争  31
      2.2 抗菌、溶菌作用  31
      2.3 诱导抗性作用  31-32
      2.4 重寄生作用  32
    3 生物防治中存在问题及解决方法  32-33
    4 展望  33-34
下篇 研究内容  34-67
  第一章 梨轮纹病和炭疽病病菌的PCR检测技术研究  35-47
    摘要  35
    ABSTRACT  35-36
    1 材料与方法  36-40
      1.1 供试菌株及梨品种  36-38
      1.2 病原菌基因组DNA的提取  38
      1.3 特异性引物的设计  38-39
      1.4 常规PCR反应  39
      1.5 巢式PCR反应  39-40
    2 结果与分析  40-45
      2.1 不同浓度炭疽病菌孢子液对梨果的致病力  40
      2.2 引物LW1/LW2特异性PCR扩增  40-41
      2.3 引物TJ1/TJ2的特异性PCR扩增  41-42
      2.4 巢式PCR和常规PCR扩增梨轮纹病菌菌株基因组DNA灵敏度比较  42-43
      2.5 接种梨病组织的PCR快速检测  43-44
      2.6 喷施轮纹菌孢子液的梨果的检测  44
      2.7 喷施炭疽菌孢子液的梨果的检测  44-45
    3 讨论  45-47
  第二章 梨黑斑病菌、轮纹病菌、炭疽病菌对常见20种化学药剂的抗药性风险评价  47-55
    摘要  47
    ABSTRACT  47-48
    1 材料和方法  48-49
      1.1 试验材料  48-49
      1.2 试验方法  49
    2 结果与分析  49-54
      2.1 常见化学药剂对梨黑斑病菌的毒力测定  49-51
      2.2 常见化学药剂对梨轮纹病菌的毒力测定  51-52
      2.3 常见化学药剂对梨炭疽病菌的毒力测定  52-54
    3 讨论  54-55
  第三章 生物化学复配剂对梨黑斑病、轮纹病、炭疽病的田间防效  55-61
    摘要  55
    ABSTRACT  55-56
    1 材料和方法  56-58
      1.1 试验材料  56-57
      1.2 试验方法  57-58
    2 结果与分析  58-60
      2.1 三种药剂处理对梨黑斑病的控制效果  58-59
      2.2 三种药剂处理对梨轮纹病的控制效果  59
      2.3 三种药剂处理对梨炭疽病的控制效果  59-60
    3 讨论  60-61
  第四章 生防菌sf-628对梨叶片苯丙氨酸解氨酶和过氧化氢酶基因表达的影响  61-67
    摘要  61
    ABSTRACT  61-62
    1 材料和方法  62-64
      1.1 供试材料  62
      1.2 主要仪器与试剂  62
      1.3 样品处理  62-63
      1.4 引物设计  63
      1.5 梨叶片RNA的提取  63
      1.6 实时荧光定量PCR  63-64
      1.7 数据处理  64
    2 结果与分析  64-66
      2.1 PAL相对表达量分析  64-65
      2.2 CAT相对表达量分析  65-66
    3 讨论  66-67
参考文献  67-79
全文总结  79-81
本论文创新点  81-83
已发表论文  83-85
致谢  85

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