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西瓜噬酸菌现有PCR检测引物评价

作　者: 邱晓静
导　师: 胡白石
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 瓜类细菌性果斑病检测分子鉴定 PCR 西瓜噬酸菌
分类号: S436.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

瓜类细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch, BFB)是一种由革兰氏阴性细菌--西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起的植物细菌性病害。这种病害严重威胁葫芦科作物产业的发展。西瓜噬酸菌能够依靠种子远距离传播,快速有效的鉴定手段对于这种入侵生物的预防和控制的重要性不言而喻。目前,随着分子生物学的进一步发展,分子生物学检测方法被广泛应用于病原菌检测领域,聚合酶链式反应(PCR)就是一种高效的检测手段,通常被用来鉴定与检测多种植物病原菌,尤其适合用于鉴定与检测通过带菌种子传播的植物病原菌病害。现已有多组引物应用于西瓜噬酸菌特异性PCR检测中,其中使用最广泛的就是选自该病原菌16SrDNA区域的引物WFB1/2,但是这组引物早在之前的研究中就被报道过不能区分出西瓜噬酸菌亲缘近种,鉴于鉴定检测技术在防治瓜类细菌性果斑病中的重要地位,以及PCR是病害研究和检验检疫部门中广泛使用的检测技术,对这些引物进行一次系统地分析、比较和研究就显得非常重要。本研究选取了72株地理来源不同的西瓜噬酸菌菌株和63株非西瓜噬酸菌菌株,用7组国内外报道的、具有代表性的西瓜噬酸菌特异性PCR引物进行检测。这些引物分别选自细菌的16SrDNA、ITS、TRAP转运系统基因和回文序列,均来源于细菌的基因组DNA。实验结果显示其中只有源自BOX回文序列的引物BX-SL1R/S-R2特异性达到检测要求；来自于细菌基因组16SrDNA区域的2对引物在3株西瓜噬酸菌亲缘菌种菌株中均出现假阳性扩增,假阴性扩增结果分别为3例和4例；来自于细菌基因组ITS区域的2对引物中,引物Aacf2/r2出现5例假阴性扩增且在6株丁香假单胞菌株中出现假阳性扩增,SEQID4/5出现3例假阴性扩增且没有假阳性扩增；来自于细菌基因组TRAP转运系统基因区域的2对引物均在燕麦褐条病菌中出现假阳性扩增,其中引物RST49/51出现6例假阴性扩增,引物Seminis WFB1/2则出现高达10例的假阴性扩增结果。从灵敏度实验中得知,引物BX-SL1R/S-R2表现尚佳,能够满足实际检测需要。综合比较而言,具有高度特异性和较高灵敏度的引物BX-SL1R/S-R2较为适合应用在西瓜噬酸菌的鉴定检测中。实验结果显示回文序列在植物病原菌的检测领域应用的值得引起我们的关注。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
第一部分文献综述  10-26
  第一章瓜类细菌性果斑病的研究进展  11-13
    1 病害的国内外研究历史及其地理分布  11-12
    2. 瓜类细菌性果斑病的发病规律及危害  12
    3. 瓜类细菌性果斑病的防治  12-13
  第二章植物病原菌的检测和鉴定技术  13-26
    1. 细菌学检测方法  13
    2. BIOLOG鉴定检测技术  13
    3. 植物病原菌的血清学检测方法  13-16
      3.1 酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)  14
      3.2 放射免疫分析法(Immuoradiometric Assay,IRMA)  14
      3.3 免疫荧光染色分析法(Immunotluorescence,IF)  14-15
      3.4 免疫荧光微菌落染色法(Immunofluorescence Colony Staining,IMCS)  15
      3.5. 免疫吸附免疫荧光染色法(Immunosorbent Immunofluorescence,ISIF)  15
      3.6 胶体金免疫层析检测法(Gold Immunochromatography Assay,GICA)  15-16
    4. 植物病原菌的分子生物学检测法  16-25
      4.1. 分子杂交检测法(Molecular Hybridization)  16-18
      4.2. 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术  18-25
    5. 环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)  25-26
第二部分研究内容  26-83
  第一章西瓜噬酸菌现有专化性PCR引物的评价  27-83
    摘要  27
    ABSTRACT  27-28
    1. 材料和方法  28-42
      1.1 材料  28-36
      1.2 方法  36-42
    2. 结果与分析  42-78
      2.1 引物Aacf2/r2  42-46
      2.2 引物BFB64/65  46-52
      2.3 引物BX-SL1R/S-R2  52-55
      2.4 引物RST49/51  55-60
      2.5 引物SEQID4/5  60-63
      2.6 引物WFBI/2  63-69
      2.7 引物Seminis WFB1/2  69-73
      2.8 部分菌株系统关系分析  73-78
    3. 小结与讨论  78-83
参考文献  83-89
附录一部分菌株序列对比  89-126
  1.1 引物Aacf2/r2假阳性PCR产物序列对比  89-92
  1.2 引物BFB64/65假阳性PCR产物序列对比  92-93
  1.3 引物RST49/51假阳性PCR产物序列对比  93-94
  1.4 引物WFB1/2假阳性PCR产物序列对比  94-95
  1.5 引物Seminis WFB1/2假阳性PCR产物序列对比  95
  1.6 部分菌株16SrDNA序列对比  95-121
  1.7 部分菌株ITS序列对比  121-126
附录二西瓜噬酸菌pyrG基因功能初析  126-137
  摘要  126
  Abstract  126-127
  1. 材料和方法  127-131
    1.1 供试菌株、质粒及培养条件  127-128
    1.2 引物  128
    1.3 突变文库的构建和突变体的筛选  128-129
    1.4 pyrG基因的突变体、互补菌株的构建  129-130
    1.5 致病性测定、HR反应  130
    1.6 生物膜的测定  130
    1.7 游动性的测定  130
    1.8 RNA的提取和RT-PCR扩增  130-131
    1.9 生长曲线测定  131
  2. 结果与分析  131-136
    2.1 基因pyrG的突变影响了AcxjLl2的致病性  131-132
    2.2 基因pyrG的突变影响了AcxjL12的HR反应  132-133
    2.3 基因pyrG的突变影响了AcxjL12的生物膜形成能力  133
    2.4 基因pyrG的突变影响了AcxjL12的游动性  133-134
    2.5 基因pyrG的突变影响了AcxjL12中his基因的表达  134-135
    2.6 基因pyrG的突变影响了AcxjL12对组氨酸的利用  135-136
  3. 讨论  136-137
参考文献  137-139
攻读硕士学位期间发表的研究论文  139-141
致谢  141

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