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黄瓜枯萎病菌磷脂酶C4基因的克隆与功能分析

作　者: 褚小静
导　师: 梁元存
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 黄瓜枯萎病菌磷脂酶C 功能致病性
分类号: S436.421
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

磷脂酶C（phospholipase C, PLC）是磷酸肌醇信号途径中的关键酶。细胞外信号通过细胞膜受体激活磷酸肌醇特异的PLC（Phosphoinositide-specific phospholipase C,PI-PLC），PLC通过催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphatidylinositol4,5-biphosphate,PIP2）水解产生二酯酰甘油（diacylglycerol, DAG）和三磷酸肌醇（trisphosphate inositol,IP3）。IP3使储存在细胞内钙池中的Ca2+释放出来，DAG和Ca2+直接激活钙调蛋白介导激活的钙离子依赖性蛋白激酶C（Protein kinase C, PKC）。它们作为细胞内的第二信使分子将外界信号转换并传导，引发细胞内的一系列反应。黄瓜是全球性的重要蔬菜作物，在黄瓜栽培面积逐年扩大和蔬菜的集约化和专业化种植过程中，黄瓜生产上的病害问题显得十分突出，尤其是黄瓜枯萎病等土传病害发病日趋严重，严重影响其产量和品质。本实验以黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）和黄瓜种子为实验材料，通过组织分离和单孢分离得到了黄瓜枯萎病菌单孢菌株；通过Blast、Conserved Domain Search及DNAMAN对番茄枯萎病菌基因组数据库中PLCs进行了分析；根据番茄枯萎病菌PLC4基因设计引物，克隆得到FoPLC4基因；根据FoPLC4基因，构建了敲除载体和回复载体，获得FoPLC4基因敲除突变体和回复突变体；通过对FoPLC4基因敲除突变体和回复突变体表型和致病性分析，明确了FoPLC4基因在致病过程中的作用。所得结果如下：1.组织分离获得病原物，将病原物进行回接实验，根据柯赫氏法则确定分离到的病原物即为黄瓜枯萎病菌。单孢分离获得45株单孢菌株，进行致病性测定，选出致病力较强的菌株。2.通过Blast确定了番茄枯萎病菌有9个PLC基因，明确其在基因组染色体上的位置，并根据位置命名。Conserved Domain Search分析，都具有PLC的典型结构特征。PLC4和PLC6具有PLC的四个基本结构；PLC1和PLC9没有EF手形区，只有PH结构域、C2区和催化区；PLC2、PLC3、PLC7、PLC8只有催化区和C2区；PLC5没有PH区。DNAMAN序列比对各PLC基因，PLC6与PLC1、PLC9具有较高的同源性。3.根据番茄枯萎病菌PLC4基因序列设计引物，克隆得到黄瓜枯萎病菌PLC4基因（FoPLC4）。对FoPLC4基因的结构进行了分析，FoPLC4基因DNA全长3282bp，没有内含子，编码1093个氨基酸，从231到334个氨基酸为PH结构域，从419到504个氨基酸为EF结构域，从510到653个氨基酸为X结构域，从775到859个氨基酸为Y结构域，从893到1041个氨基酸为C2结构域。4.根据番茄枯萎病菌基因组序列设计引物，利用基因同源重组技术，以潮霉素磷酸转移酶基因取代FoPLC4基因的部分编码区。以质粒pCB1003为基础构建了含有潮霉素B抗性标记的FoPLC4基因敲除载体。制备了黄瓜枯萎病菌原生质体，利用重组DNA载体片段进行PEG-原生质体转化，得到潮霉素B抗性转化子，通过潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物及FoPLC4基因特异性引物对转化子进行PCR筛选，进一步进行RT-PCR验证，得到了黄瓜枯萎病菌的敲除突变体△FoPLC4。5.利用质粒pCB1532构建了FoPLC4基因回复载体，以FoPLC4基因敲除突变体为初始菌株，进行原生质体转化，得到磺酰脲（Sulfonylurea, Sur）抗性转化子，通过FoPLC4基因特异性引物对转化子进行PCR和RT-PCR验证，得到回复突变体△FoPLC4/PLC4。6.通过FoPLC4基因敲除突变体和回复突变体的表型和致病性分析，发现与野生型相比，FoPLC4基因敲除突变体的气生菌丝数量明显减少，在PDA培养基上产生稀疏、蓬松的气生菌丝，菌落颜色加深；产孢量较野生型和互补菌株显著减少，与野生型相比，减少了的82.2%，并且分生孢子形态较野生型变得长；接种后△FoPLC4突变体的病情指数明显降低，与野生型相比，降低了53.3%。回复突变体能够恢复其表型和致病力。结果表明FoPLC4基因参与了黄瓜枯萎病菌菌丝生长、分生孢子产生、分生孢子形态建成及致病过程。

全文目录

符号说明  4-5
目录  5-8
中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1 前言  12-33
  1.1 黄瓜枯萎病研究进展  12-18
    1.1.1 黄瓜枯萎病发生现状  12-13
    1.1.2 黄瓜枯萎病的危害症状  13
    1.1.3 黄瓜枯萎病病原菌  13-14
    1.1.4 黄瓜枯萎病侵染源及侵染途径  14-15
    1.1.5 黄瓜枯萎病致病机制  15-16
    1.1.6 黄瓜枯萎病防治措施  16-18
      1.1.6.1 选育抗病品种  16
      1.1.6.2 农业防治  16-17
      1.1.6.3 化学防治  17-18
      1.1.6.4 生物防治  18
  1.2 尖孢镰刀菌致病基因研究进展  18-19
  1.3 磷脂酶 C 研究进展  19-30
    1.3.1 磷脂酶的种类  19-20
    1.3.2 PLC 的类型及结构  20-22
    1.3.3 磷脂酶 C 的活性调节  22-23
    1.3.4 真菌磷脂酶 C 的纯化、基因克隆及表达特征  23-24
    1.3.5 真菌磷脂酶 C 的信号途径  24-25
    1.3.6 真菌 PLC 的功能  25-30
      1.3.6.1 调控病菌的逆境胁迫反应  25-26
      1.3.6.2 参与细胞内信号途径  26
      1.3.6.3 参与营养物质的吸收利用  26-27
      1.3.6.4 参与与细胞生长、形态建成、有丝分裂及细胞壁完整性的维护  27
      1.3.6.5 参与菌丝生长  27-28
      1.3.6.6 参与孢子产生、萌发、附着胞形成及形态建成  28-29
      1.3.6.7 参与调控漆酶的表达  29
      1.3.6.8 参与致病性和毒素合成  29-30
  1.4 植物病原基因敲除功能研究  30-31
  1.5 选题的目的意义、研究内容和技术路线  31-33
    1.5.1 目的意义  31
    1.5.2 研究内容  31-32
    1.5.3 技术路线  32-33
2 材料和方法  33-53
  2.1 实验材料  33-36
    2.1.1 供试菌株  33
    2.1.2 菌株及质粒  33
    2.1.3 酶和生化试剂  33
    2.1.4 溶液配制  33-34
    2.1.5 培养基的配制  34-35
    2.1.6 供试植物  35
    2.1.7 PCR 引物  35-36
  2.2 实验方法  36-53
    2.2.1 黄瓜枯萎病菌的分离与致病性测定  36-37
    2.2.2 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因的克隆和序列分析  37-42
      2.2.2.1 番茄枯萎病菌基因组数据库中 PLCs 基因的结构分析  37
      2.2.2.2 CTAB 法提取黄瓜枯萎病菌基因组总 DNA  37-38
      2.2.2.3 PCR 反应体系及程序  38-39
      2.2.2.4 琼脂糖凝胶中 DNA 片段的回收  39
      2.2.2.5 DNA 片段与克隆载体的链接  39
      2.2.2.6 采用改进的 CaCl2法进行大肠杆菌感受态细胞的制备  39-40
      2.2.2.7 大肠杆菌的转化及筛选  40
      2.2.2.8 碱法小量提取质粒 DNA  40-41
      2.2.2.9 克隆载体的酶切鉴定  41
      2.2.2.10 DNA 序列的测定  41-42
    2.2.3 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因的功能分析  42-53
      2.2.3.1 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因敲除突变体的获得  42-49
      2.2.3.2 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因敲除突变体的互补验证  49-51
      2.2.3.3 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因突变体的表型分析和致病性  51-53
3 结果与分析  53-69
  3.1 黄瓜枯萎病菌的分离与致病性测定  53-55
    3.1.1 黄瓜尖孢镰刀菌的分离与鉴定  53-54
    3.1.2 尖孢镰刀菌的回接实验  54-55
  3.2 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因的克隆和序列分析  55-60
    3.2.1 番茄枯萎病菌基因组数据库中 PLCs 基因的序列分析  55-56
    3.2.2 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因的获得  56-60
      3.2.2.1 黄瓜枯萎病菌基因组 DNA 的提取  56-57
      3.2.2.2 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因的克隆  57
      3.2.2.3 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因测序及序列分析  57-60
  3.3 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因敲除载体的构建和突变体的获得  60-64
    3.3.1 基因敲除载体的构建策略  60-61
    3.3.2 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因片段的克隆及酶切  61-62
    3.3.3 原生质体的制备和转化  62-63
    3.3.4 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因敲除突变体的获得和验证  63-64
  3.4 黄瓜枯萎病菌△FoPLC4 突变体的互补实验  64-65
    3.4.1 互补载体构建  64-65
    3.4.2 回复突变体的获得  65
    3.4.3 黄瓜枯萎病菌 PLC4 基因回复突变体的验证  65
  3.5 突变体的表型和致病性分析  65-69
    3.5.1 FoPLC4 基因对菌丝生长的影响  65-67
    3.5.2 FoPLC4 基因参与分生孢子产生及形态建成  67-68
    3.5.3 FoPLC4 基因参与黄瓜枯萎病菌的致病过程  68-69
4 讨论  69-72
5 总结与展望  72-74
  5.1 全文总结  72
  5.2 研究展望  72-74
参考文献  74-88
致谢  88-89
攻读学位期间发表论文情况  89

黄瓜枯萎病菌磷脂酶C4基因的克隆与功能分析

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