学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

番茄黄化曲叶病毒侵染诱导番茄microRNA的差异表达

作　者: 徐庆宣
导　师: 叶敏
学　校: 云南农业大学
专　业: 农药学
关键词: microRNA 番茄 TY 高通量测序生物信息学靶基因
分类号: S436.412
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 35次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

MicroRNA(miRNA)是一类内源性的、非编码单链小RNA。miRNA作为基因表达中的一类负调控子，不仅在植物新陈代谢、器官发育及组织分化中起重要的作用，而且可以响应植物病原菌逆境胁迫，在植物感受逆境胁迫而做出适应性调整的过程中发挥着重要作用。因此，对胁迫诱导miRNA进行研究，有助于探明植物逆境适应反应的“成因机理”以及miRNA所介导的基因表达调控网络，为提高植物抵抗胁迫的能力提供新的途径。本实验以pTYj01农杆菌接种番茄黄化曲叶病毒（TY病毒）到番茄植株内，通过RT-PCR以及原位杂交检测了TY病毒在番茄植株内的侵染、复制情况。确认病毒侵染番茄植株成功后，提取植株叶片总RNA样品送样深圳华大基因检测，进行高通量测序，将测序结果分类统计后，列出植株内miRNA的差异表达情况，并挑出两个差异表达十分显著的miRNA验证其靶基因的表达情况。初步得到如下结果:1、TY侵染15天后，番茄植株中，可检测到外壳蛋白CP的表达，随着侵染天数的增加，CP的表达量也不断增加，到30d时表达量最高，这时的番茄植株表现典型的番茄黄化曲叶病毒病症状：植株严重矮化，新生番茄叶片边缘卷曲、皱缩、叶脉黄化等。2、样品测序结果进行互相比对，发现健株和染病样品同时响应的uniquesRNA为687819只占总数的15.75%，而TY侵染特异响应uniquesRNA有1459084，高达33.41%，表明样品可以很好地反应番茄叶片响应TY侵染过程中miRNA的差异变化。3、TY侵染与对照植株中已知miRNA表达比对发现，在已知的miRNA中，有147个响应TY侵染过程，侵染后表达发生显著变化的有53个，其中表达下调的有25个，表达上调有28个；在新miRNA中，TY侵染引起miRNA表达差异变化的有121个，其中表达上调的有60个，表达下调的有61个。4、差异表达miRNA代谢通路分析表明：TY侵染过程表达差异的miRNA，主要参与响应了植物-病原菌互作的信号通路中，有70个miRNA参与该信号通过，其靶标基因占该信号通路基因的30.84%；有27个miRNA参与是响应植物激素转运信号途径，其靶基因占该信号通路基因的11.89%；同时，差异表达的miRNA还参与响应了维生素c代谢途径等生物体内重要的信号通路。5、差异表达miRNA靶基因的分析和验证：miRNA869.2靶基因的分析与验证：生物信息学分析与数据库比对显示，miRNA869.2靶向三个基因，均编码乙烯合成最后一步关键酶ACOs，靶基因验证结果显示其中ACO1和ACO2在处理后无显著变化，但ACO3表达下调，与miR869.2表达上调相吻合，表明TY侵染干扰了番茄植株正常的生长素代谢途径，该信号途径也是植物免疫信号途径之一，因此TY病毒可以通过调控乙烯的合成途径影响植株的免疫信号响应，进而影响植株的抗病性。miR0155靶基因的分析与验证：生物信息学分析与数据库比对显示，miR0155可能靶向五个基因，发现五个靶基因均编码CC-NBS-LRR类蛋白，验证结果显示其中Solyc08g007630.1.1和Solyc11g068360.1.1没有扩增产物，可能源于其表达量太低。但Solyc11g069620.1.1、Solyc11g071420.1.1、Solyc11g071430.1.1均能扩增到预期大小片段的产物，且在处理后表达均上调，与miR0155表达下调相吻合，表明TY侵染干扰了番茄ETI免疫途径上游信号CC-NBS-LRR的正常响应。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
1 前言  10-23
  1.1 番茄黄化曲叶病毒病研究进展  10-14
    1.1.1 寄主范围、症状和分布  10-11
    1.1.2 分子生物学特性  11-12
    1.1.3 TYLCV检测技术  12-14
      1.1.3.1 生物学方法  12
      1.1.3.2 血清学方法  12-13
      1.1.3.3 分子生物学方法  13-14
  1.2 植物免疫研究现状  14-17
    1.2.1 病原相关分子模式触发的免疫（PAMP-triggeredimmunity，PTI）  15-16
    1.2.2 效应因子触发的免疫反应（ETI）  16-17
  1.3 miRNA研究进展  17-20
    1.3.1 植物miRNA来源和生物合成  17-18
    1.3.2 miRNA作用机制  18
    1.3.3 miRNA植物生长发育的关系  18-19
      1.3.3.1 miRNA对根的影响  19
      1.3.3.2 miRNA对花发育的影响  19
      1.3.3.3 miRNA对植物形态建成的影响  19
    1.3.4 miRNA发现与验证  19-20
  1.4 miRNA与植物免疫  20-21
    1.4.1 miRNA与PTI  20
    1.4.2 miRNA与ETI  20-21
    1.4.3 病毒侵染与寄主miRNA  21
  1.5 研究目的和意义  21-23
2 番茄黄化曲叶病毒病应答小分子RNA深度测序和生物学分析  23-39
  2.1 试验材料  23
  2.2 试验方法  23-29
    2.2.1 番茄幼苗的培育  23
    2.2.2 侵染性农杆菌的培养及接种  23
    2.2.3 TY病毒的RT-PCR检测  23-25
      2.2.3.1 总RNA的提取  23-24
      2.2.3.2 RT-PCR检测  24-25
      2.2.3.3 番茄叶片内TY相关基因引物设计  25
    2.2.4 小RNA测序流程  25-26
    2.2.5 测序结果的生物信息学分析  26-29
      2.2.5.1 小RNA数据处理  27-28
      2.2.5.2 miRNA表达谱分析  28-29
      2.5.2.3 候选miRNA预测  29
  2.3 结果与分析  29-37
    2.3.1 深度测序植物样品的获得  29-31
      2.3.1.1 植物症状表现与TY病毒RT-PCR检测  30
      2.3.1.2 植物样品的获得以及检测  30-31
    2.3.2 番茄小RNA高通量测序与生物学信息学分析  31-36
      2.3.2.1 测序结果的基本生物学分析  31-32
      2.3.2.2 测序结果的高级生物学分析  32-34
      2.3.2.3 sRNA的注释  34-35
      2.3.2.4 CK和TY处理公共及特有序列统计  35-36
    2.3.3 miRNA比对结果  36-37
  2.4 讨论  37-39
3 番茄幼叶中响应TY侵染miRNA表达谱分析及靶基因验证  39-54
  3.1 实验材料  39
  3.2 试验方法  39-42
    3.2.1 miRNA的分析  39-41
      3.2.1.1 miRNA差异分析miRNA  39
      3.2.1.2 miRNA靶基因预测  39-40
      3.2.1.3 GO富集分析  40-41
      3.2.1.4 KEGG通路分析  41
    3.2.2 miR869.2和miR0155靶基因的验证  41-42
  3.3 结果与分析  42-52
    3.3.1 miRNA的表达谱分析  42-47
      3.3.1.1 已知miRNA差异表达分析  42-43
      3.3.1.2 新miRNA表达差异分析  43-44
      3.3.1.3 新miRNA靶基因预测  44-45
      3.3.1.4 miRNAGo分析和KEGG代谢通路分析  45-47
    3.3.2 表达差异显著miRNA靶基因的分析与验证  47-52
      3.3.2.1 部分差异极显著miRNA靶基因注释  47-49
      3.3.2.2 miR869.2生物信息学分析及验证  49-50
      3.3.2.3 miR0155生物信息学分析及验证  50-52
  3.4 讨论  52-54
参考文献  54-59
致谢  59-60
附录  60-66

番茄黄化曲叶病毒侵染诱导番茄microRNA的差异表达

内容摘要

全文目录

相似论文