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中国北方马铃薯黑痣病菌融合群鉴定及遗传多样性分析

作　者: 李晓妮
导　师: 于金凤
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 立枯丝核菌 AG3融合群 5.8S rDNA-ITS区序列 SSR 遗传分化
分类号: S435.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

马铃薯Solanum tuberosum是粮、菜、饲、加工兼用型作物，已成为世界上继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。马铃薯黑痣病是马铃薯的主要病害之一。本文对中国北方地区马铃薯黑痣病菌的融合群类群进行鉴定，对不同地域来源的病原菌进行了致病性测定，并用SSR分析方法对不同地域来源的AG3融合群进行了遗传多样性分析，主要研究结果如下：1、从山东、甘肃、青海、内蒙古、河北和黑龙江六省采集马铃薯黑痣病标本300余份，分离获得251个立枯丝核菌Rhizoctonia solani菌株。核相观察结果表明，分离所得到的菌株均属于多核丝核菌。融合群测定结果表明，这些菌株分别属于多核的丝核菌AG-3、AG1-IB、AG4-HG-I、AG4-HG-II、AG4-HG-III、AG-5和AG-11融合群。其中AG-3是优势致病群，占分离菌株总数的71.31%；其次是AG4-HG-I，占15.14%；AG-11融合群菌株是国内首次从罹病马铃薯植株上分离得到。2、从各融合群中选取代表菌株进行5.8S rDNA-ITS区序列分析，结果表明，属于立枯丝核菌R. solani的5个不同融合群被划分为2个大的分支，其中属于AG-3、AG-11和AG-53个融合群的26个菌株构成第一个分支，说明在国内新分离得到的AG-11融合群菌株与AG3、AG5融合群的亲缘关系较近；第二个分支由AG1-IB和隶属于AG4的三个不同融合亚群构成，说明AG4-HG-I、AG4-HG-II和AG4-HG-III三个融合亚群菌株与AG1-IB融合群间的亲缘关系更近。3、采用麦粒-土壤接种法对马铃薯黑痣病菌的优势群AG3融合群代表菌株56株以及AG1-IB、AG4-HG-I、AG4-HG-II、AG4-HG-III、AG-5和AG-11融合群代表菌株进行苗期致病性测定。结果表明，AG3融合群的菌株普遍表现出较高水平的致病力，依据其病情指数的高低，将56个菌株划分为3个致病类群，强致病性菌株、中等致病性菌株和弱致病性菌株。另外几个不同融合群或亚群菌株致病性测定结果表明，AG1-IB、AG4-HG-I、AG4-HG-II和AG-5融合群菌株均具有较强的致病力，其平均病情指数为78.90-86.33，而AG4-HG-III和AG11融合群菌株的致病力相对较弱，平均病情指数分别为69.33和64.00。4、利用微卫星标记技术对来自山东、甘肃、内蒙古、青海、河北和黑龙江6省的66个AG3融合群菌株进行遗传多样性分析。10对SSR引物共检测到观测等位基因（Na）35个，有效等位基因（Ne）数量为22个，不同位点的Shannon’s信息指数（I）居于1.22-0.42之间；基因多样性指数（Nei’s）变化范围在0.22-0.67之间。其中，采自内蒙古及青海省的菌株，Shannon’s信息指数（I）和基因多样性指数（Nei’s）较高，说明以上两区域的基因型更为丰富。利用NTSYS-PC2.1软件对5个地区菌株的地理群进行UPGMA聚类分析，在遗传一致度为0.70时，5个地理群可分为两个大的类群，第一类群由黑龙江、甘肃、山东的菌群构成，且山东和甘肃的菌群遗传一致度较高，达到0.87；第二类群由内蒙古、和青海的菌群构成，遗传一致度为0.88。证明AG3融合群菌株的遗传分化与该群的地理位置有较明显的相关性。

全文目录

英文缩略表  4-5
目录  5-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1 引言  12-25
  1.1 马铃薯黑痣病的研究现状  12-17
    1.1.1 马铃薯黑痣病的发病规律  12-14
      1.1.1.1 马铃薯黑痣病的症状  12
      1.1.1.2 侵染循环  12-13
      1.1.1.3 发病条件  13-14
    1.1.2 病原  14-15
    1.1.3 马铃薯黑痣病的防治  15-17
      1.1.3.1 农业防治  15
      1.1.3.2 药剂防治  15-16
      1.1.3.3 生物防治  16
      1.1.3.4 dsRNA 或真菌病毒对丝核菌防治方面的应用  16-17
      1.1.3.5 实时荧光定量 PCR 技术在土传病害定量检测中的应用  17
  1.2 丝核菌的分类概况  17-20
    1.2.1 丝核菌的分类特征  19-20
    1.2.2 菌丝融合群分类法在丝核菌上的应用  20
      1.2.2.1 多核丝核菌及融合群划分  20
      1.2.2.2 双核丝核菌及融合群划分  20
  1.3 分子生物学技术在丝核菌系统演化研究中的意义及作用  20-21
  1.4 微卫星技术及其应用  21-24
    1.4.1 概念  21
    1.4.2 微卫星技术的基本特征  21-22
    1.4.3 微卫星产生机制  22
    1.4.4 微卫星位点引物的筛选  22
    1.4.5 SSR 分子标记的应用  22-24
      1.4.5.1 遗传图谱的构建  22
      1.4.5.2 遗传标记  22-23
      1.4.5.3 遗传多样性分析  23-24
  1.5 本研究的目的意义  24-25
2 材料方法  25-35
  2.1 供试菌株的分离和鉴定  25
  2.2 菌株的培养性状及核相观察  25-26
  2.3 供试菌株的菌丝融合群鉴定  26
  2.4 供试菌株 DNA 的提取  26-27
    2.4.1 提取试剂  26-27
    2.4.2 所用仪器  27
    2.4.3 DNA 提取步骤  27
  2.5 马铃薯黑痣病菌的 5.8S RDNA-ITS 区序列分析  27-29
    2.5.1 供试菌株及试剂  27-28
    2.5.2 PCR 扩增  28
    2.5.3 特异性扩增片段的回收及检测  28-29
  2.6 特异扩增片段的克隆  29
    2.6.1 克隆反应体系的建立  29
    2.6.2 转化  29
    2.6.3 单克隆检测  29
  2.7 序列测定及分析  29
  2.8 优势融合群菌株及不同融合群菌株的致病性测定  29-30
    2.8.1 麦粒培养基的配制  29-30
    2.8.2 马铃薯种薯的处理  30
    2.8.3 温室接种测定致病性  30
  2.9 AG3 融合群的 SSR 体系的建立及遗传多样性分析  30-35
    2.9.1 SSR 标记所需特异性引物  30-31
    2.9.2 SSR-PCR 扩增反应体系  31-32
    2.9.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳  32-33
      2.9.3.1 所需试剂的配制  32
      2.9.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳  32-33
      2.9.3.3 银染  33
    2.9.4 数据分析  33-35
3 结果与分析  35-59
  3.1 中国北方地区马铃薯黑痣病菌的融合群组成和分布  35-42
  3.2 病原菌的培养性状及核相观察  42-43
    3.2.1 培养性状观察  42-43
    3.2.2 菌株的核相观察  43
  3.3 马铃薯黑痣病菌 5.8S rDNA-ITS 区序列分析  43-45
  3.4 中国北方地区立枯丝核菌不同融合群菌株的系统发育关系分析  45-46
  3.5 马铃薯黑痣病菌的致病性测定  46-51
    3.5.1 优势融合群 AG3 菌株的致病性测定  46-50
    3.5.2 马铃薯黑痣病菌其它融合群菌株的致病性测定  50-51
  3.6 基于 SSR 标记的 AG3 融合群遗传多样性分析  51-59
    3.6.1 微卫星引物对 AG3 融合群的扩增  51-54
    3.6.2 SSR 位点遗传多样性分析  54-55
    3.6.3 AG3 群群体内和群体间的遗传分化  55
    3.6.4 AG3 融合群种群遗传多样性分析  55-56
    3.6.5 基于 SSR 标记的 AG3 融合群聚类分析  56-57
    3.6.6 AG3 融合群菌株不同地理群体间的遗传距离  57-59
4 讨论  59-63
  4.1 关于马铃薯黑痣病菌的融合群组成  59
  4.2 关于丝核菌 5.8S rDNA-ITS 区序列分析的问题  59-60
  4.3 关于 AG3 融合群菌株的 SSR 标记  60-63
    4.3.1 SSR 引物的筛选  60-61
    4.3.2 AG3 融合群菌株的遗传多样性分析  61-63
参考文献  63-71
致谢  71-72
攻读学位期间发表论文情况  72

中国北方马铃薯黑痣病菌融合群鉴定及遗传多样性分析

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