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14-3-3基因对稻瘟病菌生长、发育和致病性的影响

作　者: 尹升明
导　师: 刘浩
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 稻瘟病菌 14-3-3暴因 产孢 渗透压 致病性
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


14-3-3蛋白是一种高度保守的酸性调节蛋白,广泛存在于各种真核生物细胞中。14-3-3蛋白由两个大约30kD同源或者异源的单体构成二聚体,从而发挥作用。在低等真核生物中一般有两个14-3-3基因,缺失一个对生长影响不是很大,敲除两个之后一般是致死的。在酵母中,14-3-3基因对菌丝生长,细胞循环和形态变化有重要影响,另外14-3-3基因对细胞内的各种信号途径也有一定的影响。稻瘟病是由稻瘟病菌引起的一种毁灭性病害,给全世界的水稻生产带来巨大的危害。稻瘟病菌属于子囊菌,在闭子囊壳上产生纺锤形弯曲的子囊孢子,具有典型的生活史和侵染循环过程,被认为是研究植物与病原菌相互关系的典型模型。稻瘟病菌从孢子萌发形成芽管,芽管顶端弯曲形成附着胞,附着胞通过侵染栓结构来穿透植物表皮并形成菌丝体,从而完成侵染循环过程。本文主要是阐述14-3-3蛋白在稻瘟病菌生长、发育和致病性中的起的作用,主要的研究成果如下：(1)通过与其它真菌序列比对,在稻瘟病菌数据库中找到2个14-3-3基因,两个基因分别为RAD24与RAD25;(2)分别构建敲除载体,采用AMTM转化的方法,得到△14-3-3(1)与△14-3-3(2)突变株各两株；(3)△14-3-3(1)与△14-3-3(2)突变株与野生型相比在CM与PA培养基上菌落稍微减小,在用于产孢的PA培养基上菌丝稀疏,表明14-3-3基因增强稻瘟病菌的生长速率；(4)△14-3-3(1)与△14-3-3(2)突变株对渗透压敏感,尤其在0.5M CaCl2渗透压的CM培养基上敏感性很强,说明14-3-3基因能够增强稻瘟病菌对高渗环境的耐受能力；(5)△14-3-3(1)与△14-3-3(2)突变株产孢量和产孢速率有所增加,一般是野生株的2倍,说明14-3-3基因能够增强稻瘟病菌的产孢能力；(6)△14-3-3(1)与△14-3-3(2)突变株孢子萌发和附着胞形成均延迟,说明14-3-3基因能够增强孢子对外界信号的感知能力；(7)△14-3-3(1)与△14-3-3(2)突变株的致病性与野生型相比没有变化,仍有正常侵染叶片的能力,说明14-3-3基因并不影响稻瘟病菌的侵染能力；(8)将两个基因全部敲除之后,稻瘟病菌与低等真菌相似,无法在培养基上生长。14-3-3蛋白是真核生物种十分重要的调节蛋白,在丝状真菌中的研究很少,在稻瘟病菌中尚属首次,本研究选题新颖；同时稻瘟病菌作为一种模式菌株,研究方法对其它丝状真菌的研究可以起到借鉴作用。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-23
  1.1 稻瘟病菌  9-15
    1.1.1 稻瘟病与稻瘟病菌  9
    1.1.2 稻瘟病菌的病害周期和侵染循环  9-11
    1.1.3 稻瘟病菌侵染相关信号传导途径  11-15
  1.2 14-3-3 蛋白  15-20
    1.2.1 14-3-3 蛋白的简介  15-16
    1.2.2 14-3-3 蛋白的结构  16-17
    1.2.3 14-3-3 蛋白的功能  17-20
  1.3 本论文研究内容和意义  20-23
    1.3.1 研究内容  20-21
    1.3.2 研究意义  21-23
2 材料和方法  23-37
  2.1 材料  23-28
    2.1.1 菌种及质粒  23
    2.1.2 工具酶及相关试剂  23-24
    2.1.3 主要仪器和设备  24-25
    2.1.4 培养基及培养条件  25-28
  2.2 方法  28-37
    2.2.1 稻瘟病菌总DNA及RNA的提取  28-29
    2.2.2 琼脂糖DNA凝胶电泳  29-30
    2.2.3 酶切和连接反应体系及过程  30-32
    2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法  32-33
    2.2.5 农杆菌电转感受态的制备与转化  33-34
    2.2.6 菌落PCR验证  34
    2.2.7 农杆菌与M.grisea孢子共培养  34
    2.2.8 菌落生长速率及产孢量  34
    2.2.9 渗透压实验  34-35
    2.2.10 稻瘟病菌产孢培养、孢子收集和附着胞诱导培养  35
    2.2.11 稻瘟病菌附着胞的诱导  35
    2.2.12 菌丝生长实验  35
    2.2.13 糖原染色  35-36
    2.2.14 大麦离体接种  36
    2.2.15 DAPI及FM4-64染色  36-37
3 结果与讨论  37-61
  3.1 M.grisea 14-3-3基因的分离和克隆  37-39
  3.2 敲除载体pLH2,pLH4,及pLH12的构建  39-47
    3.2.1 M.grisea基因组的提取  41
    3.2.2 稻瘟病菌敲除基因片段PCR  41-43
    3.2.3 质粒和目的基因1的酶切和连接  43-44
    3.2.4 质粒pLH1,pLH3和pLH11酶切验证  44
    3.2.5 pLH1,pLH3和pLH11质粒与目的片段2的酶切与连接  44-46
    3.2.6 pLH2,pLH4与pLH12质粒的验证  46-47
  3.3 构建质粒转入农杆菌AGL1  47-48
  3.4 敲除菌株的验证  48-50
  3.5 突变株表型分析  50-52
    3.5.1 突变体的菌落直径  50-51
    3.5.2 突变体的菌丝形态  51-52
  3.6 突变体对渗透压的耐受性  52-54
  3.7 突变体菌丝的生长过程  54
  3.8 突变体产孢量变化  54-56
  3.9 突变体孢子萌发及附着胞形成  56-58
  3.10 分生孢子在亲水界面上的生长  58
  3.11 糖原的胞内分布  58-59
  3.12 突变体的致病性  59-60
  3.13 DAPI及FM4-64染色  60-61
4 结论  61-62
5 展望  62-63
6 参考文献  63-71
7 论文发表情况  71-72
8 致谢  72

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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