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禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选及抑菌特性研究

作　者: 朱明杰
导　师: 胡元森
学　校: 河南工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 禾谷镰刀菌拮抗解淀粉芽孢杆菌抑菌特性
分类号: S435.121.45
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

禾谷镰刀菌是引起小麦赤霉病的主要病原菌,也是粮食储藏及食品生产过程中的有害菌。该菌在田间繁殖引起的农作物病害不仅降低粮食产量,还能在小麦等谷物籽粒上产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)等毒素,对人体及动物健康造成严重危害。抑制禾谷镰刀菌的生长繁殖是降低小麦赤霉病害发生及毒素形成的基本前提,利用生物拮抗作用防治小麦赤霉病害,对提高粮食生产的数量和质量均有重要意义。本文首先从多地发生赤霉病的麦田土壤中分离、筛选出禾谷镰刀菌拮抗菌株,对该菌株进行分类鉴定,分离并确定发酵液中部分抑菌物质,对该物质的抑菌作用机理进行了初步分析,获得如下研究结果：(1)从24份土壤样品中筛选出8株禾谷镰刀菌的拮抗菌株,经过抑菌效果比较,Jc-07号菌株抑菌效果最强。对Jc-07菌株进行形态学观察、生理生化指标测定及16SrDNA序列分析,将Jc-07号菌株初步鉴定为芽孢杆菌属中的解淀粉芽孢杆菌。(2)对Jc-07菌株发酵液进行温度、pH值、紫外照射稳定性测试,发现该菌株发酵液呈稳定状态的温度范围为40℃-60℃、酸碱度范围为pH3.0-9.0、紫外照射时间在0.5-3小时之内都呈稳定状态,发酵液中抑菌物质对上述条件的变化相对稳定。(3)通过对发酵培养基、发酵温度、发酵时间、摇床转速以及培养基初始pH的单因素分析以及以发酵时间、发酵温度、摇床转速和培养基初始pH为四因素进行的正交试验分析,JC-07菌株产抑菌物质发酵的最优组合为发酵时间72h,发酵温度37℃,摇床转速220r/min,培养基初始pH8.0,四因素对发酵效果影响的大小顺序为发酵温度>培养基初始pH>发酵时间>摇床转速。(4)通过对发酵液多次硫酸铵盐析,透析除盐、离子交换层析,葡聚糖柱层析等步骤分离出抑菌蛋白,并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测出该蛋白的分子量约为56Kd,发酵液中抑菌蛋白浓度约为1.67mg/mL,该蛋白不含苯环、含有糖基和a-氨基酸。(5)初步研究了该蛋白对禾谷镰刀菌的抑菌机理,发现该抑菌蛋白对禾谷镰刀菌菌丝及孢子具有致畸作用、能抑制禾谷镰刀菌的孢子萌发、对菌体内以还原糖为底物的生化反应和能量传递以及菌体内可溶性蛋白或生物酶的合成都有一定的抑制作用。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章前言  11-20
  1.1 禾谷镰刀菌基本概况  11
  1.2 禾谷镰刀菌对田间作物的危害  11-12
  1.3 禾谷镰刀菌对粮食储藏及食品生产的危害  12
  1.4 有害霉菌的防治策略研究进展  12-18
    1.4.1 化学防治方法  13
    1.4.2 培育抗性品种  13-14
    1.4.3 生物防治  14-18
      1.4.3.0 生物防治的发展  14-15
      1.4.3.1 真菌在生物防治中的应用  15
      1.4.3.2 生防细菌的来源  15-16
      1.4.3.3 生防细菌的一般作用机理  16
      1.4.3.4 芽孢杆菌作为生防菌的应用及发展  16-17
      1.4.3.5 解淀粉芽孢杆菌的发展及应用  17-18
  1.5 本研究的目的意义及内容  18-20
第二章材料与方法  20-29
  2.1 材料与设备  20-22
    2.1.1 实验材料  20
    2.1.2 实验仪器  20-21
    2.1.3 培养基  21
    2.1.4 主要试剂  21-22
  2.2 实验方法及步骤  22-29
    2.2.1 禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选及鉴定  22
      2.2.1.1 禾谷镰刀菌拮抗菌的初筛  22
      2.2.1.2 禾谷镰刀菌拮抗菌的复筛  22
    2.2.3 拮抗菌菌株的鉴定  22-23
      2.2.3.1 菌体形态观察  22-23
      2.2.3.3 生理生化指标测定  23
      2.2.3.5 菌株16SrDNA序列测定  23
    2.2.4 Jc-07抑菌谱实验  23
      2.2.4.1 Jc-07对动物病原细菌的抑菌作用检测  23
      2.2.4.2 Jc-07对常见粮食霉菌的抑制作用  23
    2.2.5 菌株Jc-07发酵液对禾谷镰刀菌的抑菌稳定性  23-24
      2.2.5.1 Jc-07菌株发酵液的制备  23-24
      2.2.5.2 Jc-07菌株发酵液对温度的稳定性  24
      2.2.5.3 Jc-07菌株发酵液对酸碱的稳定性  24
      2.2.5.4 Jc-07菌株发酵液对紫外辐射的稳定性  24
    2.2.6 解淀粉芽孢杆菌Jc-07菌株抑菌作用的发酵条件优化  24-25
      2.2.6.1 Jc-07种子液的培养  24
      2.2.6.2 单因素实验优化Jc-07菌株发酵条件  24-25
      2.2.6.3 正交试验优化Jc-07菌株发酵  25
    2.2.7 抑菌物质的分离纯化  25-26
      2.2.7.1 硫酸铵盐析  25
      2.2.7.2 硫酸铵沉淀的除盐  25-26
      2.2.7.3 Sepharose Fast Flow离子交换层析和SephadexG-75凝胶柱层析  26
      2.2.7.4 抑菌蛋白浓度的测定  26
    2.2.8 抑菌蛋白分子量的测定  26-27
    2.2.9 抑菌蛋白基本结构初步分析  27
      2.2.9.1 蛋白的双缩脲反应  27
      2.2.9.2 抑菌蛋白的硝化反应  27
      2.2.9.3 蒽酮反应  27
      2.2.9.4 α-氨基酸的测定  27
    2.2.10 抑菌蛋白抑菌机理的初步研究  27-29
      2.2.10.1 抑菌物质对禾谷镰刀菌菌丝形态的影响  27
      2.2.10.2 抑菌蛋白对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响  27-28
      2.2.10.3 抑菌物质对禾谷镰刀菌菌体还原糖吸收的影响  28
      2.2.10.4 抑菌物质对禾谷镰刀菌体内蛋白质的影响  28
      2.2.10.5 菌体内N-乙酰葡萄糖胺含量的测定  28-29
第三章结果与分析  29-54
  3.1 禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选与鉴定  29-35
    3.1.1 禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选  29-30
    3.1.2 Jc-07拮抗菌株的分类鉴定  30-33
      3.1.2.1 形态特征  30
      3.1.2.2 JC-07菌株生理生化鉴定  30-31
      3.1.2.3 分子生物学方法鉴定  31-33
    3.1.3 Jc-07菌株的抗菌谱实验  33-34
    3.1.4 小结与讨论  34-35
  3.2 Jc-07菌株发酵液的稳定性  35-37
    3.2.1 Jc-07菌株发酵液对热的稳定性  35-36
    3.2.2 Jc-07菌株发酵液抑菌活性对酸碱度的稳定性  36
    3.2.3 紫外照射对Jc-07菌株发酵液抑菌活性的影响  36-37
    3.2.4 小结与讨论  37
  3.3 拮抗菌Jc-07产抑菌物质发酵条件的优化  37-41
    3.3.1 单因素实验条件分析  37-40
      3.3.1.1 最佳发酵培养基的选择  37-38
      3.3.1.2 发酵时间对Jc-07产抑菌物质的影响  38-39
      3.3.1.3 发酵温度对Jc-07产抑菌物质的影响  39
      3.3.1.4 摇床转速对Jc-07产抑菌物质的影响  39-40
      3.3.1.5 培养基初始pH值对Jc-07产抑菌物质的影响  40
    3.3.2 正交试验优化发酵条件  40-41
    3.3.3 小结与讨论  41
  3.4 发酵液中抑菌物质的提取与纯化  41-45
    3.4.1 抑菌物质的粗提取  41
    3.4.2 抑菌粗蛋白的纯化  41-43
    3.4.3 抑菌蛋白浓度的测定  43-44
    3.4.4 抑菌蛋白分子量的测定  44-45
    3.4.5 小结与讨论  45
  3.5 蛋白基本结构组成的初步分析  45-48
    3.5.1 双缩脲反应  45-46
    3.5.2 抑菌蛋白的硝化反应  46
    3.5.3 糖基的测定  46-47
    3.5.4 抑菌物质的α-氨基酸测定  47
    3.5.5 小结与讨论  47-48
  3.6 抑菌蛋白抑菌机理的初步研究  48-54
    3.6.1 抑菌物质对禾谷镰刀菌菌丝形态的影响  48
    3.6.2 抑菌物质对禾谷镰刀菌孢子萌发的影响  48-50
    3.6.3 抑菌物质对禾谷镰刀菌菌体内还原糖的影响  50-51
    3.6.4 抑菌物质对禾谷镰刀菌菌体可溶性蛋白的影响  51
    3.6.5 抑菌物质对N-乙酰葡萄糖胺的影响  51-52
    3.6.6 小结与讨论  52-54
第四章结论及建议  54-55
参考文献  55-59
致谢  59-60
作者简介  60

禾谷镰刀菌拮抗菌的筛选及抑菌特性研究

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