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禾谷镰刀菌中Homeobox基因的功能分析

作　者: 郑文辉
导　师: 王宗华；鲁国东
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物病理学
关键词: 禾谷镰刀菌同源异型盒基因同源异型盒结构域
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引起全球性大麦、小麦等作物赤霉病的主要病原菌。该菌致病后除了造成产量损失外,还产生多种真菌毒素,严重威胁人类和动物的食品安全。但迄今对该菌生长发育、产孢过程、毒素合成和侵染循环等关键阶段的规律,特别是其分子调控机制的认识还十分有限,有待于深入研究。同源异型盒基因作为一类转录调控因子,在真核生物的个体发育及细胞分化的调控中起着重要作用。通过生物信息学方法明确禾谷镰刀菌全基因组中含有13个同源异型盒基因。运用同源重组方法对这13个基因进行了逐个敲除,发现Fghft8基因缺失突变体菌落呈茂盛的绒球状,生长速度严重减慢,气生菌丝分枝增多,但菌体生长减慢并不影响其生物量的积累和产孢及侵染致病的能力。通过基因互补实验,证实了FgHTF8基因不仅能够互补自身突变体的生长缺陷还能异源互补稻瘟病菌Mohox1基因缺失突变体的生长缺陷。Fghtr5基因缺失突变体失去了从分生孢子梗产孢的能力,产孢量大大减少,但能通过菌丝末端缢裂产生含有菌丝长柄或缢裂缺口的分生孢子,这些分生孢子能够正常萌发和侵染致病。基因互补实验证实FgHTF5基因能够互补其自身突变体的产孢缺陷。FgHTF8和FgHTFs基因的双敲除突变体表现为生长速度严重减慢,而且几乎失去了产生分生孢子的能力,说明两个Homeobox基因在调控菌丝生长和分生孢子分化过程中可能没有明显的交互作用。对FgHtf13蛋白的定位表明：该蛋白在孢子萌发的0h、4h和8h都能观察到稳定表达的GFP信号,并且荧光区域能和DAPI染色后的细胞核区域叠合,说明了FgHtf13蛋白定位于细胞核,这和转录因子具有的细胞核定位特征相一致。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
第一章文献综述  11-21
  1 Homeobox基因及其功能的多样性  11-15
    1.1 Homeobox基因的由来  11
    1.2 Homeobox基因的结构和进化  11-12
    1.3 Homeobox基因在不同物种中的功能  12-15
      1.3.1 动物中的Homeobox基因  12-13
      1.3.2 植物中的Homeobox基因  13-14
      1.3.3 菌物中的Homeobox基因  14-15
  2 禾谷镰刀菌研究概况  15-19
    2.1 禾谷镰刀菌引起严重的小麦赤霉病  15-16
    2.2 禾谷镰刀菌的特征和生活史  16
    2.3 禾谷镰刀菌分子遗传学的研究进展  16-19
      2.3.1 毒素合成过程中的分子生物学研究  16-17
      2.3.2 功能基因组学的研究  17-19
  3 本研究的目的和意义  19-21
第二章材料与方法  21-36
  1 实验材料  21-25
    1.1 供试菌株  21
    1.2 致病性鉴定材料  21
    1.3 质体载体  21-24
    1.4 各类培养基、抗生素及生化试剂  24-25
      1.4.1 培养基  24-25
      1.4.2 各类抗生素  25
      1.4.3 生化试剂  25
  2 实验方法  25-36
    2.1 禾谷镰刀菌中Homeobox基因的生物信息学分析  25-26
      2.1.1 禾谷镰刀菌中Homeobox蛋白序列的获得  25-26
      2.1.2 Homeodomain蛋白不同结构域的分析  26
      2.1.3 同源异型盒结构域序列的比对  26
      2.1.4 蛋白质理化性质、空间结构和在生物体中的定位分析  26
      2.1.5 真核生物中Homeodomain蛋白的演化关系分析  26
    2.2 禾谷镰刀菌基因组DNA的快速提取及质量检测  26-27
    2.3 DNA琼脂糖电泳  27
    2.4 PCR扩增  27-28
    2.5 PCR产物的胶回收  28
    2.6 PCR产物的TA克隆  28
    2.7 Escherichia coli DH5α感受态细胞的制备  28-29
    2.8 感受态细胞的转化  29
    2.9 质粒DNA的提取  29
    2.10 质粒酶切与连接  29-30
    2.11 禾谷镰刀菌中13个Homeobox基因敲除载体的构建  30-31
    2.12 FgHTF8互补载体的构建  31
    2.13 FgHTF5-GFP和FgHTF13-GFP融合互补载体的构建  31
    2.14 禾谷镰刀菌原生质体制备和转化  31-32
    2.15 稻瘟病菌原生质体制备和转化  32
    2.16 FgHTF5和FgHTF8基因的双敲除  32-33
    2.17 菌落生长速度测定  33
    2.18 产孢量统计  33
    2.19 孢子和菌丝形态观察  33-34
    2.20 孢子萌发率测定  34
    2.21 禾谷镰刀菌有性交配  34
    2.22 小麦离体水培单花注射接种  34-35
    2.23 拟南芥喷雾接种  35
    2.24 小麦胚芽鞘接种  35-36
第三章结果与分析  36-61
  1 生物信息学结果及分析  36-42
    1.1 禾谷镰刀菌Homeobox基因的获得及蛋白结构域分析  36-37
    1.2 禾谷镰刀菌Homeodomain蛋白的同源异型盒结构域比较分析  37-39
    1.3 禾谷镰刀菌Homeodomain蛋白的理化特性分析  39-40
    1.4 禾谷镰刀菌Homeodomain蛋白的系统进化分析  40-42
  2 禾谷镰刀菌中Homeobox基因的功能分析  42-59
    2.1 禾谷镰刀菌Fghtf基因敲除突变体的筛选与鉴定  42-43
    2.2 Fghtf基因缺失突变体对禾谷镰刀菌营养生长、产孢、有性生殖及致病性的影响  43-46
    2.3 Fghtf8突变体菌丝的分枝增多,但不影响致病性  46-49
    2.4 FgHtf8互补菌株的筛选及其表型分析  49-50
    2.5 Fghtf5突变体无法从分生孢子梗上分化出分生孢子,所产生的分生孢子多为畸形  50-55
    2.6 FgHtf5互补菌株的筛选及其表型分析  55-56
    2.7 FgHTF8和FgHTF5基因的双敲除鉴定和表型分析  56-57
    2.8 FgHtf13不同时间段的细胞核定位观察  57-59
  3 禾谷镰刀菌Homeobox基因异源互补稻瘟病菌突变体分析  59-61
    3.1 FgHTF8能够异源互补稻瘟病菌Mohox1的生长缺陷  59-61
第四章全文总结讨论及后续研究  61-65
  1 全文总结讨论  61-63
  2 后续研究  63-65
参考文献  65-75
附录1 本研究中所采用的引物序列及其用途  75-80
附录2 攻硕期间发表的论文  80-81
致谢  81

禾谷镰刀菌中Homeobox基因的功能分析

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