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Ospgip基因在水稻抗纹枯病育种上的应用

作　者: 张丽娜
导　师: 徐敬友
学　校: 扬州大学
专　业: 植物病理学
关键词: 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因单氨基酸替换超表达抗纹枯病育种水稻
分类号: S435.111
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase inhibiting protein, PGIP)是一种植物细胞壁结构蛋白,可特异性结合真菌内切多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases, PG),从而抑制其活性,在植物抗真菌病害过程中起重要作用。本研究具体结果如下：通过PCR技术克隆了Ospgipl基因,该基因具有一930bp的完整开放阅读框(ORF),无内含子,终止密码子为TAA。将其与超表达载体pCMBIA1301连接,以农杆菌介导法转入粳稻品种徐稻3号愈伤组织超表达,并对转化植株后代进行田间抗性鉴定,筛选获得对纹枯病抗性有显著提高的水稻新品系。大田抗病性鉴定结果表明,可降低病级1.0-1.2级(9级分类标准),农艺性状与亲本无显著差异。同法克隆Ospgip2基因,该基因具有1029bp的完整开放阅读框(ORF),无内含子,终止密码子为TAA。生物信息学分析表明,OsPGIP2由342个氨基酸组成,含有10个LRR重复序列。将对水稻纹枯病菌PG无抑制活性的OsPGIP2LRR区氨基酸进行点突变,通过对表达产物的提取和测定,选择表达产物获得对PG抑制活性的突变体转入水稻,以期获得抗性明显提高的水稻抗纹枯病新品系。据相关文献与生物学信息分析结果设计引物,分别替换OsPGIP2LRR区3个氨基酸,获得突变体OsPGIP2L233F、OsPGIP2R253Q和OsPGIP2Q300H。突变体原核表达结果表明,将OsPGIP2第233位氨基酸由L突变成F时,可使得对水稻纹枯病菌PG无抑制活性的OsPGIP2获得抑制活性,活力为876U/mL。将突变基因转入载体pCMBIA1301超表达后,以农杆菌介导的方法转化水稻愈伤。苗期抗性鉴定结果表明,获得的无性系苗期对R. solani抗性增强且发病时间延迟。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-8
符号说明  8-9
文献综述  9-22
  1 水稻纹枯病  9-12
    1.1 发生、危害与防治  9-11
      1.1.1 发生与危害  9
      1.1.2 病害的防治及存在问题  9-11
    1.2 水稻抗纹枯病育种现状  11-12
      1.2.1 抗性种质的筛选  11-12
      1.2.2 转基因育种  12
  2 植物抗病基因  12-15
    2.1 抗病基因种类  12-13
    2.2 作用机理  13-14
    2.3 抗病育种  14-15
  3 植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)  15-21
    3.1 PGIP的分布  16-17
    3.2 PGIP的结构及特性  17-19
      3.2.1 PGIP结构  17-19
      3.2.2 PGIP的理化特性  19
    3.3 PGIP在抗病育种中的作用  19-21
      3.3.1 植物抗病因子  19-20
      3.3.2 PGIP的抗病机理  20-21
      3.3.3 PGIP的抗病育种前景  21
  4 本课题研究目的和意义  21-22
  5 课题的创新性或创造性  22
1 材料与方法  22-35
  1.1 试验材料  22-23
  1.2 水稻基因组DNA的提取(CTAB法)  23-25
  1.4 PCR扩增  25
    1.4.1 水稻Ospgip基因的PCR扩增  25
    1.4.2 水稻Ospgip2突变基因的PCR扩增  25
  1.5 载体构建  25-27
    1.5.1 克隆载体的构建  25-26
    1.5.2 原核表达载体的构建  26
    1.5.3 超表达载体的构建  26-27
  1.6 感受态细胞的制备与转化  27
    1.6.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  27
    1.6.2 质粒转化  27
  1.7 重组质粒的验证  27-30
    1.7.1 提取质粒试剂的配制  28
    1.7.2 重组质粒的提取(碱裂解法)  28
    1.7.3 酶切验证  28-30
    1.7.4 生物信息学分析  30
  1.8 原核表达产物的提取与检测  30-31
    1.8.1 OsPGIP包涵体粗蛋白的提取  30-31
    1.8.2 病菌PG酶的提取  31
    1.8.3 表达产物SDS-PAGE检测  31
  1.9 表达产物抑制PG活性测定  31-33
  1.10 根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立  33-34
    1.10.1 农杆菌感受态细胞的制备  33
    1.10.2 外源质粒导入农杆菌  33
    1.10.3 愈伤组织的培养及转基因植株的获得  33-34
  1.11 田间病害抗性鉴定  34-35
    1.11.1 田间试验设计  34-35
    1.11.2 菌系及接种方法  35
    1.11.3 病级调查  35
2 结果与分析  35-54
  2.1 转Ospgip1基因水稻对纹枯病的研究  35-41
    2.1.1 水稻Ospgip1基因的克隆与生物信息学分析  35-38
      2.1.1.1 水稻Ospgip1基因的克隆和序列分析  35-37
      2.1.1.2 蛋白质一级结构分析  37-38
    2.1.2 Ospgip1基因在水稻中的过表达  38-41
      2.1.2.1 表达载体的构建与验证  38-39
      2.1.2.2 重组质粒导入农杆菌  39
      2.1.2.3 转Ospgip1基因植株的获得与抗性鉴定  39-41
  2.2 转Ospgip2突变基因水稻对纹枯病的抗性  41-54
    2.2.1 水稻Ospgip2基因的克隆和生物信息学分析  41-46
      2.2.1.1 水稻Ospgip2基因的克隆和序列分析  41-43
      2.2.1.2 蛋白质一级结构分析  43-45
      2.2.1.3 蛋白质二级结构分析  45
      2.2.1.4 蛋白质三级结构分析  45-46
      2.2.1.5 其它特性预测  46
    2.2.2 OsPGIP2 LRR区单氨基酸替换  46-50
      2.2.2.1 碱基突变序列的获得  46-48
      2.2.2.2 氨基酸突变序列分析  48-50
    2.2.3 Ospgip2突变基因的原核表达  50-52
      2.2.3.1 表达载体的构建  50
      2.2.3.2 转化  50-51
      2.2.3.3 诱导表达  51
      2.2.3.4 表达产物对水稻纹枯病菌PG的抑制作用  51-52
    2.2.4 突变基因Ospgip2~(L233F)在水稻中的过表达  52-54
      2.2.4.1 表达载体的构建与转化  52-53
      2.2.4.2 转Ospgip2~(L233F)基因植株的获得与抗病性鉴定  53-54
3 讨论  54-58
  3.1 转基因技术在植物抗病遗传育种上的应用  54-55
  3.2 Pgip基因在植物抗病遗传育种中的应用  55-56
  3.3 定点突变技术是研究基因功能的重要手段  56-58
参考文献  58-65
附录  65-68
致谢  68-69

Ospgip基因在水稻抗纹枯病育种上的应用

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