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稻瘟病菌转录因子MoAp1的定位机制以及转录辅阻遏物MoTup1的生物学功能研究

作　者: 翟素
导　师: 张正光
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌 ROS MoApl定位 MoTupl 生长分生孢子产生致病性
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产上最具破坏性的病害之一,严重威胁着全球水稻的生产安全。随着稻瘟病菌全基因组测序以及分子生物学的不断发展,对其基因功能进行研究从而了解其生长发育及致病分子调控机制,进而寻找新的药物靶标来防治稻瘟病,逐渐成为一种有效的手段。所有生物体都要面临来自体内和外界的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的威胁。粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)转录因子Papl可以应答外界低浓度的H202胁迫,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中与Papl同源的Yap1同样可以激活氧化压力应答基因,抵抗氧化胁迫。通常,Yapl存在于细胞质中,这是通过输出蛋白Crm1对Yapl的核输出实现的,Crm1可以直接与Yapl的核输出序列(NES)结合,在小G蛋白Gsp1/Ran的共同作用下,将Yapl运输至细胞质中；当外界存在氧化压力时,Yap1被氧化,构象发生改变,致使NES不能被Crm1识别从而滞留于核内以行使其转录因子的功能。本实验室郭敏等对稻瘟病菌中与粟酒裂殖酵母转录因子Pap1高度同源的bZIP转录因子MoAp1的功能进行了研究,证明稻瘟病菌MoAp1与活性氧应答有关。基于这些研究结论,本文第一章重点对MoAp1的定位机制进行了分析,发现MoAp1定位于分生孢子的细胞质,而经过2mM H2O2处理后,MoAp1可以定位到细胞核中；侵染大麦24h后,侵染菌丝中MoAp1的定位也是在细胞核；而缺失N端预测的核定位信号(NLS)后,MoAp1在2mM H2O2处理的条件下不能进入细胞核;另外,我们在稻瘟病菌中鉴定了与酵母Crml和Gsp1同源的MoCrml和MoGsp1,发现其编码基因均难以敲除,表明其对于稻瘟病菌是必需的,而两者沉默后均不影响稻瘟病菌对水稻及大麦的致病性,但影响MoAp1由细胞核向细胞质转运。上述结果表明,MoAp1调控稻瘟病菌对外界活性氧的应答,调控机制可能与酵母Ap1类似,关键在于细胞核定位,而N端NLS功能域对其定位及功能具有关键作用；MoAp1由细胞核向细胞质转运需要MoCrml和MoGsp1的共同参与。Tup1-Cyc8复合物是最早被确定的转录辅阻遏物之一,通过与转录激活／阻遏蛋白的互作参与葡萄糖和氧气利用、DNA损伤和细胞类型这些过程的调控。Tup1-Cyc8对于调控动物和植物病原真菌的二态性和致病性有着重要的作用。Alberto Eli’as-Villalobos等对玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis) Tupl的功能研究发现,Tupl对于正常的交配和菌丝形成是必需的,并且影响肿瘤形成和孢子产生,对于整个病原发育过程至关重要。本文第二章从稻瘟病菌全基因组数据库中鉴定了一个与酿酒酵母(S. cerevisiae)辅阻遏蛋白Tup1同源的蛋白MoTup1,其编码基因MoTUP1在分生孢子阶段上调表达；MoTUP1缺失突变体生长速率显著降低,且固体培养基上的菌落及液体培养基里的菌丝丛形态与野生型菌株均有差异；突变体不能产生分生孢子；使用突变体液培菌丝丛接种水稻和大麦叶片,均不能引起水稻和大麦发病；采用创伤接种的方法,发现突变体在水稻和大麦上致病性均显著下降；显微观察发现突变体菌丝顶端能形成附着胞,但不能侵入寄主表皮细胞,而MoTUP1互补菌株可以恢复以上表型。上述结果表明,MoTup1参与调控稻瘟病菌的生长发育及其对寄主的致病性。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
上篇文献综述  11-39
  第一章植物与病原生物互作中ROS的功能研究  12-26
    1 生物体内ROS的产生及其作用  12-13
    2 植物与病原物互作过程中ROS的作用  13-19
      2.1 植物体氧迸发与其抗病性的关系  13-14
      2.2 植物病原生物体内ROS平衡与致病性的关系  14-15
      2.3 真菌活性氧应答机制  15-19
    参考文献  19-26
  第二章转录辅阻遏物Tup1-Cyc8的研究概述  26-39
    1 Tup1-Cyc8复合物——典型的辅阻遏物  26-27
    2 Tup1-Cyc8抑制转录的模式  27-30
      2.1 传统经典的三种模式  27-28
      2.2 新的模式：Tup1-Cyc8遮盖激活结构域  28-30
    3 Tup1调控病原真菌二态性和毒性的研究进展  30-32
    参考文献  32-39
下篇研究内容  39-80
  第一章稻瘟病菌转录因子MoAp1的定位机制研究  40-60
    1 材料与方法  42-48
      1.1 供试菌株的培养及保存方法  42
      1.2 稻瘟病菌基因组DNA、RNA提取及cDNA的制备  42-43
      1.3 实时定量PCR分析  43
      1.4 MoCrm1和MoGsp1的蛋白序列分析  43-44
      1.5 MoCRM1和MoGSP1沉默突变体的获得  44-45
      1.6 MoAp1的亚细胞定位  45-46
      1.7 MoCRM1和MoGSP1沉默突变体的表型测定  46-47
      1.8 MoCRM1和MoGSP1沉默突变体致病性分析  47-48
    2 结果分析  48-55
      2.1 MoCrm1和MoGsp1的蛋白序列分析  48
      2.2 MoCRM1和MoGSP1沉默突变体的获得  48-50
      2.3 MoCRM1和MoGSP1沉默均不影响稻瘟病菌的致病性  50-51
      2.4 MoCRM1沉默突变体对H_2O_2的耐受性降低  51-52
      2.5 MoAp1侵染菌丝阶段定位于细胞核  52
      2.6 缺失NLS后的MoAp1亚细胞定位不再受H_2O_2调控  52-53
      2.7 MoAp1由细胞核向细胞质转运受MoCrm1及MoGsp1介导  53-55
    3 讨论  55-57
    参考文献  57-60
  第二章稻瘟病菌转录辅阻遏物MoTup1的生物学功能研究  60-80
    1 材料与方法  62-66
      1.1 供试菌株保存与培养  62
      1.2 稻瘟病菌基因组DNA、RNA提取及cDNA的制备  62
      1.3 MoTup1的蛋白结构预测及系统发育分析  62-63
      1.4 稻瘟病菌MoTUP1敲除突变体的获得  63-65
      1.5 MoTUP1敲除突变体表型观测  65
      1.6 MoTUP1敲除突变体致病性分析  65-66
      1.7 MoTUP1敲除突变体菌丝附着胞形成能力及穿透侵入观察  66
      1.8 MoTup1亚细胞定位  66
    2 结果分析  66-75
      2.1 稻瘟病菌MoTup1的蛋白结构预测及系统发育分析  66-68
      2.2 MoTUP1在分生孢子阶段上调表达  68
      2.3 MoTUP1敲除突变体及其互补菌株的获得  68-69
      2.4 MoTUP1敲除导致稻瘟病菌生长显著减慢  69-71
      2.5 MoTUP1敲除突变体不产生分生孢子  71
      2.6 MoTUP1敲除突变体致病性丧失  71-72
      2.7 MoTUP1敲除突变体菌丝体顶端附着胞丧失侵入能力  72-73
      2.8 MoTUP1敲除突变体在创伤后的大麦及水稻叶片上致病性显著下降  73-74
      2.9 MoTup1亚细胞定位观察  74-75
    3 讨论  75-77
    参考文献  77-80
附录1  80-82
附录2  82-84
附录3  84-94
攻读硕士学位期间发表的研究论文  94-96
致谢  96

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