学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

邻硝基苯甲醛高效降解菌株Pseudomonas putida ONBA-17分离、生物学特性及废水处理生物强化研究

作　者: 虞方伯
导　师: 李顺鹏
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 邻硝基苯甲醛 序批式活性污泥法 处理模型构建 降解菌 生物强化
分类号: X172
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
下　载: 87次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


随着我国工业化进程的加快，有机工业合成废水的排放量越来越大，已对环境造成了严重的污染，威胁到人类生命健康。邻硝基苯甲醛（o-nitrobenzaldehyde，ONBA）作为一种重要的有机精细化工中间体，广泛用于医药、染料和有机合成，工业需求量十分大。但由于其生产过程伴随着大量污染物质的产生，发达国家已将其生产线转移到发展中国家（污染转移），这一点在我过东南部地区尤为明显。为揭示其对环境的危害，为今后实施的中试乃至工业化规模相匹配的（同类）废水的活性污泥法处理提供一定的设计和运行参考依据；并在研究实施生物强化可行性的同时，从活性污泥相的构成变化、区系变化及优势种群微生物的分离和特性研究等方面着手，试图探寻相关的评判依据、理化基础和科学指引，我开展了本项研究。本研究从邻硝基苯甲醛工业废水水质特征、组份及ONBA的毒性调查入手，证实其具有高CODCr、高悬浮物含量、高盐和着色（棕红）等特点；水相部份含有2-乙基辛醇、ONBA、邻硝基苯甲醇、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异辛酯等有机物，其中又以ONBA为主；经急性毒性试验分析，发现其半致死剂量(LD50)分别为291.84mg／kg（经灌胃给药途径）和172.98 mg／kg（经腹腔注射给药途径），依据急性毒性分级标准，将其毒性评定为中等毒性。在对其危害和污染特征有所了解之后，在实验室条件下构建起数套序批式反应器（Sequencing batch reactor，SBR），并分别以水力停留时间和污泥停留时间为变量研究了活性污泥量与CODCr及总氮去除率之间的关系。得到了能为实际工程设计提供重要参考依据的水处理模型——Se=Ks（1+6·θc）／[θC（Y·K-b）-1]=996（1+0.197θc）／（0.73θc-1）和X=Y（S0-Se）·θC／θH（1+6·θC）=0.342（S0-Se）·θC／θH（1+0.197·θC）。在对处理前后反应器中活性污泥变化的研究中发现：与接种污泥相比，驯化污泥在沉降性能方面有所提升。进一步研究发现，沉降性能的提升与污泥多聚物中蛋白质／碳水化合物比值下降有关；活性污泥结构逐渐密实化，丝状菌比例有所下降；微生物区系结构发生显著变化。分别运用荧光原位杂交和变性梯度电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术揭示了活性污泥中微生物区系的变化情况。证实当SBR系统取得预期处理效果后，活性污泥中的优势微生物种群为Beta和Alpha变形菌。而将基于原位分析和PCR扩增分析的上述两种方法用于同一区系变化的研究，其所得结果更具说服力和全面性。为实现ONBA的特异降解，并为后续生物强化的实施提供种源，我以活性污泥为初始接种物进行了降解菌的分离，得到多株具有ONBA降解能力的细菌菌株。经比较分析后，选取其中一株编号为ONBA-17的菌株进行后续研究．该菌株能在12 h内降解100 mg／mL的ONBA，并具备一定的芳香化合物降解谱；菌体最适生长温度为28℃；最适生长pH值为7.6；最适碳源为果糖，对果糖和甘露糖等简单碳源的利用要好于二糖碳源（如乳糖和蔗糖）；最适氮源为酵母膏，单一组份氮源中氯化铵最易为菌体所利用；最适生长盐浓度在3.5％附近，属中度嗜盐菌；能耐多种重金属和抗生素。在对其培养特征、生理生化特性、16S rDNA序列、G+C mol％含量及DNA-DNA杂交研究和分析之后，将该菌株鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），命名为Pseudomonas putida ONBA-17。随后，又对其粗酶提取物进行了研究，发现粗酶液最适作用温度和酸碱环境分别为30℃和pH7.4．构建了粗酶液反应体系；研究了金属离子、EDTA和表面活性剂对其活性的影响。结果表明，Li+、Ni2+和Co4+对酶促反应有较强抑制作用，而Ca2+、Mg2+和Mn2+则起激活作用。以吐温20、吐温80和SDS为代表的表面活性剂对粗酶液存在很强的抑制作用。其中SDS能够完全抑制其活性，EDTA也抑制了约一半左右的酶活；证实负责ONBA降解的酶（系）属胞内酶。此外，还对其降解途径和降解基因定位进行了研究，初步判断该降解基因存在于菌体染色体之上。通过三亲结合的方法，将外源gfp基因插入了P．putida ONBA-17的染色体中，并同过在固体和液体LB培养基中的连续传代，证实了插入片段的稳定性；在对SBR反应器中的活性污泥施行生物强化后发现，实行生物强化处理（接种标记菌株）能明显缩短系统启动期。但与对照相比，其在耐负荷冲击和运行稳定性方面略逊一筹。意味着在未经某一（或几）种污染物污染的环境系统中，蕴含有足够的基因种类（或遗传多样性）以应对类物质，前提是给系统以足够的适应驯化期。通过荧光和激光共聚焦（Confocal laser scanning microscopy，CLSM）显微镜观测，监测了标记菌株在反应器中的存活情况。再结合反应器的运行效果及标记菌株的平板计数情况，认为接种物环境适应和系统保留能力、与土著微生物的竞争能力及抗原生动物捕食能力与接种物存留和生物强化效果密切相关。为了研究施行生物强化对活性污泥中微生物区系造成的影响，并为后续优势菌群的分离提供一定的指导依据，我通过DGGE技术监测了反应装置中细菌区系的演替情况。发现生物强化较处理环境对污泥中微生物区系的影响远小。不同处理的反应器的DGGE图谱仅在初始阶段和末期有所区分，一部分α、β变形菌及未知菌（群）逐渐成为了运行系统中的优势菌群。通过直接平板涂布法获得了4株差异明显的细菌菌株，并对其进行了鉴定和特性研究。结果表明，编号依次为R，S，W和M的菌株其分类地位分别归属Exiguobacterium sp．，Pseudomonas sp．，Bacillus cereus和P．aeruginosa；这4株菌与DGGE图谱分析中的部分条带的16S rRNA基因v3区序列同源；有着良好的聚凝能力和疏水性能。聚凝指数分别为79.5％，83.1％，90.0％和81.2％，远较50％的界定标准高；上述菌株与降解菌株ONBA-17之间无显著ONBA降解能力、成膜能力及聚凝能力促增作用。但菌株R与ONBA-17和S之间有明显的生长促增作用。通过后续主要碳源利用实验及培养液的GC-MS分析，发现混合培养较单菌培养在物质代谢利用方面存在差异。在本研究之前，国际上未见ONBA降解菌及其生物强化研究的相关报道，国内也无此类废水的相关处理模型。因而，本研究具备一定的创新性和理论价值，能为后续研究提供一定的研究基础，起到抛砖引玉的作用。

全文目录


摘要  11-14
Abstract  14-18
符号与缩略语说明  18-20
文献综述  20-59
  第一章 我国工业废水排、治及生物处理技术概述  20-39
    1 我国工业废水排、治概况  21-23
      1.1 工业废水仍然是我国水环境污染的重要污染源  21-22
      1.2 水污染严重的几个传统行业在国民经济中仍居主要地位  22-23
    2 废水生物处理技术概述  23-35
      2.1 废水的好氧生物处理技术  23-31
        2.1.1 活性污泥法  23-26
        2.1.2 好氧生物处理技术进展  26-31
      2.2 废水的厌氧生物处理技术  31-34
        2.2.1 废水厌氧生物处理技术的产生与发展  31-32
        2.2.2 厌氧生物反应器与工艺  32-34
      2.3 废水的生态处理技术  34-35
        2.3.1 氧化塘  34
        2.3.2 人工湿地处理系统  34
        2.3.3 土地处理系统  34-35
    3 本章小结  35
    参考文献  35-39
  第二章 微生态研究中的分子生物学方法及生物强化在活性污泥处理系统中的应用  39-59
    1 废(污)水处理系统中微生态研究的分子生物学方法  39-49
      1.1 基于聚合酶链反应技术的群落总DNA指纹图谱分析  39-43
        1.1.1 梯度凝胶电泳分析  41
        1.1.2 单链构象多态性分析  41-42
        1.1.3 扩增核糖体DNA限制性分析  42
        1.1.4 末端荧光标记限制性片段长度多态性分析  42
        1.1.5 随机扩增多态性DNA分析  42-43
        1.1.6 核糖体基因间隔序列分析  43
      1.2 核酸杂交分析技术  43-45
      1.3 报告基因监测技术  45-46
      1.4 生物标志物法  46-47
        1.4.1 脂肪酸类图谱分析  46
        1.4.2 醌指纹法分析  46-47
      1.5 其他分析方法  47-49
        1.5.1 Biolog板分析法  47
        1.5.2 DNA生物传感器  47-48
        1.5.3 稳定性同位素探测技术  48-49
    2 生物强化在活性污泥处理系统中的应用  49-52
      2.1 生物强化的定义及成功应用实例  49-50
      2.2 衡量生物强化成败的标准及影响其实施效果的因素  50-52
        2.2.1 接种物来源  50-51
        2.2.2 聚凝能力  51
        2.2.3 菌体密度  51
        2.2.4 表型改观  51
        2.2.5 其它可利用底物  51-52
        2.2.6 土著微生物代谢产物  52
        2.2.7 寄生及原生动物捕食  52
    参考文献  52-59
试验部分  59-152
  第一章 SBR中邻硝基苯甲醛工业废水处理模型的构建及处理前后活性污泥变化的研究  59-96
    1 材料与方法  60-72
      1.1 供试样品  60
      1.2 废水水质特征分析方法  60-64
        1.2.1 总悬浮物的重量法测定  60
        1.2.2 挥发性悬浮物的测定  60
        1.2.3 COD_(Cr)测定  60-61
        1.2.4 氨氮的纳氏比色法测定  61-62
        1.2.5 总氮的测定(碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法)  62
        1.2.6 总磷的测定(钼酸铵分光光度法)  62-63
        1.2.7 pH值的测定(玻璃电极法)  63
        1.2.8 色度的测定(稀释倍数法)  63
        1.2.9 水样中ONBA含量的测定  63-64
        1.2.10 水样中部分有机物质的定性分析  64
      1.3 ONBA急性毒性试验  64
        1.3.1 试验方法  64
        1.3.2 实验动物处理  64
        1.3.3 剂量设计  64
        1.3.4 半数致死剂量统计分析  64
      1.4 SBR反应器中废水处理模型的构建  64-66
        1.4.1 小试反应器的构建  64-65
        1.4.2 SBR运行条件设定  65-66
      1.5 处理前后反应器中活性污泥的变化  66-72
        1.5.1 活性污泥的理化性质分析  66-67
        1.5.2 活性污泥的扫描电子显微镜观察  67-68
        1.5.3 活性污泥中微生物优势种群的分析  68-72
    2 结果与讨论  72-91
      2.1 ONBA工业废水水质分析  72-73
      2.2 ONBA急性毒性分析  73-76
      2.3 SBR反应器中废水处理模型的构建  76-79
        2.3.1 HRT对TN和COD去除效率的影响  76
        2.3.2 SRT对TN和COD去除效率的影响  76-77
        2.3.3 动力学参数的确定  77-78
        2.3.4 废水水处理模型的构建  78-79
      2.4 处理前后SBR反应器中活性污泥的变化  79-91
        2.4.1 活性污泥的理化性质分析  79-80
        2.4.2 活性污泥相变化的扫描电子显微镜分析  80-82
        2.4.3 活性污泥中微生物优势种群的分析  82-91
    3 本章小结  91-92
    参考文献  92-96
  第二章 ONBA降解菌的分离、筛选、鉴定及降解特性研究  96-123
    1 材料与方法  96-103
      1.1 ONBA降解菌的富集、分离和筛选  96-97
      1.2 ONBA降解菌的培养特征及分类地位鉴定  97-100
        1.2.1 ONBA降解菌的培养特征及生理生化鉴定  97
        1.2.2 降解菌株的电子显微镜成像拍摄  97
        1.2.3 降解菌株16S rDNA序列的扩增及其系统发育分析  97-98
        1.2.4 菌株G+C mol%的测定  98-99
        1.2.5 DNA-DNA同源性测定  99-100
      1.3 降解菌株ONBA-17的生长特性研究  100-101
        1.3.1 温度、pH值、通气量、氮源和碳源对其生长的影响  100
        1.3.2 NaCl浓度对降解菌株ONBA-17生长的影响  100
        1.3.3 降解菌株ONBA-17最小抑制浓度测试  100-101
      1.4 降解菌株ONBA-17的降解特性研究  101
        1.4.1 菌株ONBA-17的芳香化合物降解谱调查  101
        1.4.2 添加营养物质(葡萄糖和酵母粉)、接种量、通气量、pH和温度对其降解ONBA的影响  101
      1.5 降解代谢途径推测  101-102
      1.6 粗酶提取物作用特性的研究  102-103
        1.6.1 粗酶液的提取  102
        1.6.2 可溶性蛋白质含量的测定  102
        1.6.3 粗酶液反应体系的建立  102
        1.6.4 金属离子、EDTA和表面活性剂对酶活性的影响  102
        1.6.5 酶的定域实验  102-103
      1.7 质粒的检测  103
      1.8 菌株ONBA-17的废水修复潜力测试  103
    2 结果与讨论  103-120
      2.1 ONBA降解菌株的富集、分离和筛选  103-104
      2.2 降解菌株ONBA-17的培养特征及分类地位鉴定  104-108
        2.2.1 菌株ONBA-17的培养特征及生理生化鉴定  104-106
        2.2.2 降解菌株ONBA-17的16S rDNA序列扩增及其系统发育分析  106-108
        2.2.3 降解菌株ONBA-17的G+C mol%含量测定  108
        2.2.4 DNA同源性分析结果  108
      2.3 P.putida ONBA-17的生长特性研究  108-112
        2.3.1 温度对其生长的影响  108-109
        2.3.2 pH对其生长的影响  109
        2.3.3 通气量对其生长的影响  109
        2.3.4 碳、氮源对其生长的影响  109-110
        2.3.5 氯化钠浓度对其生长的影响  110-111
        2.3.6 MICs测试  111-112
      2.4 P.putida ONBA-17的降解特性研究  112-115
        2.4.1 菌株ONBA-17的芳香化合物降解谱调查  112
        2.4.2 添加营养物质(葡萄糖和酵母粉)、接种量、通气量、pH和温度对其降解ONBA的影响  112-115
      2.5 代谢途径初探  115-116
      2.6 粗酶提取物作用特性的研究  116-119
        2.6.1 粗酶液反应体系的建立  116-118
        2.6.2 金属离子、EDTA和表面活性剂对酶活性的影响  118-119
        2.6.3 酶的定域研究  119
      2.7 质粒的检测  119
      2.8 菌株ONBA-17的废水修复潜力测试  119-120
    3 本章小结  120-121
    参考文献  121-123
  第三章 SBR系统中ONBA降解菌Pseudomonas putida ONBA-17的生物强化应用  123-141
    1 材料与方法  123-128
      1.1 材料  123
        1.1.1 菌株、质粒  123
        1.1.2 酶和试剂  123
        1.1.3 抗生素及使用浓度  123
      1.2 方法  123-128
        1.2.1 ONBA降解菌P.sp ONBA-17的gfp标记  123-126
        1.2.2 SBR反应器的设置和运行  126-127
        1.2.3 菌体计数  127
        1.2.4 反应器处理效果分析  127
        1.2.5 激光共聚焦显微镜观测  127
        1.2.6 污泥中微生物区系的DGGE分析  127
        1.2.7 核酸序列登录  127-128
    2 结果与讨论  128-137
      2.1 ONBA降解菌P.putida ONBA-17的gfp标记  128-130
        2.1.1 gfp的获取  128
        2.1.2 同源重组载体的构建  128-130
        2.1.3 三亲接合及稳定性验证  130
      2.2 生物强化效果分析  130-132
        2.2.1 COD和ONBA去除情况分析  130-132
        2.2.2 反应系统中污泥沉降性能的变化  132
      2.3 ONBA-17gfp的存活情况  132-133
      2.4 污泥微生物区系的DGGE分析  133-135
      2.5 生物强化部分的深入讨论  135-137
      2.6 后续研究建议  137
    3 本章小结  137-138
    参考文献  138-141
  第四章 生物强化系统中微生物的分离、鉴定及特性研究  141-152
    1 材料与方法  141-143
      1.1 菌株的分离  141
      1.2 菌株的鉴定  141-142
        1.2.1 菌株的培养特征及生理生化鉴定  141
        1.2.2 菌株16S rDNA序列的获得及分析  141-142
        1.2.3 核酸序列登录  142
      1.3 菌株的絮凝、疏水、成膜及ONBA降解能力测试  142
        1.3.1 菌株聚凝能力测试  142
        1.3.2 菌体细胞表面疏水性能测试  142
        1.3.3 菌株成膜能力测试  142
        1.3.4 菌株ONBA降解能力测试  142
      1.4 菌株促增现象解析  142-143
        1.4.1 菌体碳源利用情况分析  142
        1.4.2 菌体培养液的GC-MS分析  142-143
    2 结果与讨论  143-150
      2.1 菌株的分离  143-144
      2.2 菌株的鉴定  144-146
        2.2.1 菌株的生理生化特点  144
        2.2.2 基于部分16S rDNA序列的系统发育分析  144-145
        2.2.3 与DGGE测序条带的聚类分析情况  145-146
      2.3 菌株的絮凝、疏水、成膜及ONBA降解能力分析  146-148
        2.3.1 聚凝能力分析  146
        2.3.2 细胞表面疏水性能分析  146-147
        2.3.3 菌株成膜能力测定  147-148
        2.3.4 菌株ONBA降解能力的测定  148
      2.4 菌株促增现象解析  148-150
        2.4.1 菌株碳源利用情况分析  148-149
        2.4.2 菌株培养液的GC-MS分析  149-150
    3 本章小结  150
    参考文献  150-152
全文总结  152-154
本论文的创新之处  154-155
附录Ⅰ 所用培养基及试剂配方  155-157
附录Ⅱ 研究中获得的相关DNA序列  157-167
致谢  167-168
攻读博士学位期间发表的文章  168

相似论文

  1. 稻飞虱肠道细菌多样性分析,S435.112.3
  2. 草除灵高效降解菌的分离鉴定、降解特性及降解途径的研究,X172
  3. 产表面活性剂的石油降解菌的筛选及其特性的研究,X172
  4. 畜禽屠宰血液混合菌种液态发酵的研究,S816.4
  5. 生物催化/光催化联合降解毒死蜱的研究,X592
  6. 复混肥中缩二脲对作物毒害的临界值与缩二脲降解菌的研究,S143
  7. Phanerochaete sp. HSD的锰依赖性过氧化物酶产酶优化及微菌丝球强化处理染料废水,X703
  8. 降解红霉素工程菌的构建及其在水源水曝气生物滤池预处理中的应用,X703
  9. 高效油脂降解菌剂构建与效果研究,X703
  10. 人工湿地处理农村生活污水与运行优化调控研究,X703
  11. 高效菌强化OAO工艺处理焦化废水的试验研究,X703
  12. 降解多环芳烃高效菌及生物活性炭的研制,X703
  13. 新型手性单噁唑啉类配体的合成及其在催化不对称Henry反应中的应用研究,O643.36
  14. AB法污水处理工艺功能升级试验研究,X703
  15. 筛选高效纤维素降解菌及利用秸秆发酵酒精初步研究,S38
  16. 喹啉降解菌的研究及在柴油脱氮中的应用,X172
  17. 好氧颗粒污泥及其高效菌株降解氯苯胺的试验研究,X703
  18. 难降解有机污染物废水处理的生物菌剂法研究,X703
  19. 产絮凝剂微生物强化处理校园污水的研究,X703
  20. A_1菌特性及其强化处理污水研究,X703
  21. 填料ABR-SBR法深度处理大蒜加工生产废水,X703

中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境微生物学
© 2012 www.xueweilunwen.com