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酿酒酵母在不同环境下有机酸的代谢途径分析及调控

作　者: 李晓军
导　师: 赵长新
学　校: 大连工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酿酒酵母碳源酶活动力学代谢流分析高渗胁迫代数
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

酵母既是一种重要的工业微生物，又是代谢工程的基础研究中一种较好的模式生物。但对于其在不同的环境及不同代数等情况下胞内产生的系统而精细的代谢过程的调控还不是十分清楚，这些方面的研究一直是基础理论与生产实践中的热点问题。本文通过发酵过程生长参数的分析、酶活性检测和代谢通量分析研究了S. cerevisia在不同的环境及不同代数等情况下，胞内代谢体系的响应及细胞自身的这种代谢调控的机理。本实验以葡萄糖、果糖和麦芽糖为碳源，连续培养S. cerevisiae，测量了在不同培养条件下中间代谢途径一些具有代表性的酶活性，包括糖酵解途径(丙酮酸激酶，PYK)，磷酸戊糖途径(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，G6PDH)，三羧酸循环(异柠檬酸脱氢酶，ICDH；苹果酸脱氢酶，MDH)，乙醇脱氢酶(YADH)。初步分析了为了适应不同的环境胞内代谢体系的一些主要酶活性的响应，为代谢通量的分析提供一些基础信息，并且整合了发酵过程的生长相关参数，基于μ=μ(t)的反应动力学模型，主要研究S. cerevisiae分别以葡萄糖、果糖和麦芽糖为碳源的情况下为了适应不同的环境而产生的胞内代谢响应。本实验研究了指数生长期的S. cerevisiae在高渗胁迫下的生理代谢。甘油和海藻糖是酿酒酵母的主要相容性溶质。在高渗环境下，胞外酒精浓度、甘油浓度、海藻糖含量分别较对照提高100%、400%和11%。代谢流分析表明，高渗环境下，从节点6-磷酸葡萄糖合成海藻糖的碳流较常规培养增加了47.3%；从节点磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛合成甘油的碳流增加了55.7%；从节点丙酮酸流向乙醇的碳流增加了300%，而流向三羧酸循环的流量减少了21.7%。本实验对不同代数啤酒酵母在丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活性特征方面的差异进行了比较分析，发现酵母在不断传代过程中，胞内代谢关键酶活性均呈现一定变化，而丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和乙醇脱氢酶变化最为明显，并且与酵母活力有着紧密的联系，当3种酶活性高时，酵母活力旺盛，代谢物质的量较为协调。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章文献综述  11-19
  1.1 代谢工程的研究范畴  11-12
  1.2 代谢工程对生物工程领域的作用与意义  12
  1.3 代谢分析的研究方法  12-16
    1.3.1 代谢通量分析（MFA）  12-13
    1.3.2 代谢控制分析（MCA）  13-15
    1.3.3 生化系统理论（BST）  15
    1.3.4 途经分析（PA）  15-16
    1.3.5 控制论模型（CM）  16
  1.4 酵母代谢工程  16-17
  1.5 酵母发酵过程中的基本调控  17-18
  1.6 本课题的研究工作  18-19
    1.6.1 本课题的研究意义  18
    1.6.2 本课题的主要研究内容  18-19
第二章 S.cerevisiae 以葡萄糖、果糖和麦芽糖为碳源条件下中间代谢途径关键酶活分析  19-27
  2.1 材料与方法  19-22
    2.1.1 菌种  19
    2.1.2 培养基  19-20
      2.1.2.1 斜面培养基  19-20
      2.1.2.2 种子培养基  20
      2.1.2.3 发酵培养基  20
    2.1.3 培养条件  20
    2.1.4 细胞的收获  20
    2.1.5 酶蛋白提取  20
    2.1.6 酶活性检测  20-21
    2.1.7 酶蛋白含量测定  21-22
    2.1.8 酶比活力计算  22
  2.2 结果与讨论  22-25
    2.2.1 糖酵解和磷酸戊糖途径中关键酶活性变化  22-23
    2.2.2 三羧酸循环中关键酶活性变化  23-25
    2.2.3 乙醇脱氢酶活性变化  25
  2.3 本章小结  25-27
第三章 S.cerevisiae 在不同碳源培养条件下的代谢流分析  27-44
  3.1 材料与方法  27-31
    3.1.1 菌种  27
    3.1.2 培养基  27-28
      3.1.2.1 斜面培养基  27-28
      3.1.2.2 种子培养基  28
      3.1.2.3 发酵培养基  28
    3.1.3 有机酸标准溶液的配置  28
    3.1.4 培养条件  28
    3.1.5 细胞干重的测定  28
    3.1.6 酒精的测定  28-29
    3.1.7 还原糖的测定  29
    3.1.8 有机酸的测定  29
    3.1.9 动力学模型  29-30
      3.1.9.1 酵母菌菌体生长动力学模型的建立  29-30
      3.1.9.2 产物生成动力学模型的建立  30
      3.1.9.3 底物消耗动力学模型的建立  30
    3.1.10 代谢通量的计算  30-31
  3.2 结果与讨论  31-43
    3.2.1 不同碳源培养条件下酿酒酵母的代谢特性  31-35
    3.2.2 不同碳源培养条件下的发酵动力学方程  35-38
      3.2.2.1 葡萄糖培养条件下发酵动力学方程及各模型参数的确定  35-36
      3.2.2.2 果糖培养条件下发酵动力学方程及各模型参数的确定  36-37
      3.2.2.3 麦芽糖培养条件下发酵动力学方程及各模型参数的确定  37-38
    3.2.3 不同碳源培养条件下代谢网络的建立及发酵过程中代谢通量分析  38-43
  3.3 本章小结  43-44
第四章 S.cerevisiae 在高渗培养条件下的代谢流分析  44-57
  4.1 材料与方法  44-47
    4.1.1 菌种  44
    4.1.2 培养基  44-45
      4.1.2.1 斜面培养基  44
      4.1.2.2 种子培养基  44
      4.1.2.3 发酵培养基  44-45
    4.1.3 有机酸标准溶液的配置  45
    4.1.4 培养条件  45
    4.1.5 甘油的测定  45-46
    4.1.6 胞内海藻糖的测定  46
    4.1.7 细胞干重的测定  46
    4.1.8 酒精的测定  46
    4.1.9 还原糖的测定  46-47
    4.1.10 有机酸的测定  47
    4.1.11 代谢通量的计算  47
  4.2 结果与讨论  47-56
    4.2.1 高渗胁迫下酿酒酵母的代谢特性  47-50
    4.2.2 代谢网络的构建  50-52
    4.2.3 代谢流分析  52-53
    4.2.4 节点代谢流分布  53-55
    4.2.5 能量代谢流分析  55-56
  4.3 本章小结  56-57
第五章不同代数啤酒酵母对胞内代谢关键酶活性的影响  57-65
  5.1 材料与方法  57-59
    5.1.1 菌种  57
    5.1.2 培养基  57-58
      5.1.2.1 斜面培养基  57
      5.1.2.2 种子培养基  57-58
      5.1.2.3 发酵培养基  58
    5.1.3 培养条件  58
    5.1.4 葡萄糖浓度的测定  58
    5.1.5 酵母数的测定  58
    5.1.6 细胞的收获  58
    5.1.7 酶蛋白提取  58-59
    5.1.8 酶活性检测  59
    5.1.9 酶蛋白含量测定  59
    5.1.10 酶比活力计算  59
  5.2 结果与讨论  59-63
    5.2.1 不同代数酵母对发酵降糖速率的影响  59-60
    5.2.2 不同代数酵母细胞增殖的变化  60
    5.2.3 中间代谢途径关键酶活性分析  60-63
      5.2.3.1 糖酵解和磷酸戊糖途径中关键酶活性变化  61-62
      5.2.3.2 三羧酸循环中关键酶活性变化  62-63
      5.2.3.3 乙醇脱氢酶活性变化  63
  5.3 本章小结  63-65
第六章结论与展望  65-67
  6.1 结论  65-66
  6.2 展望  66-67
参考文献  67-71
附录 A 葡萄糖培养时代谢节点平衡方程式  71-72
附录 B 葡萄糖培养时不同代谢产物的化学计量关系和代谢反应式  72-73
附录 C 果糖培养时代谢节点平衡方程式  73-74
附录 D 果糖培养时不同代谢产物的化学计量关系和代谢反应式  74-75
附录 E 麦芽糖培养时代谢节点平衡方程式  75-76
附录 F 麦芽糖培养时不同代谢产物的化学计量关系和代谢反应式  76-77
硕士期间研究成果  77-78
致谢  78

酿酒酵母在不同环境下有机酸的代谢途径分析及调控

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