学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

高盐稀态酱油发酵中酵母菌株耐盐基因GPD1的研究

作　者: 于雁飞
导　师: 曹小红
学　校: 天津科技大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: GPD1 S酵母 S3-2 耐盐性
分类号: TS264.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 6次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


酱油质量是酱油行业发展的关键,而酱油品质主要取决于酱油风味。酱油风味的好坏与酱油发酵的酵母菌种密切相关。但是,在高盐稀态发酵后期的盐水发酵中含有17%的食盐,这种特殊的环境对微生物的生长繁殖很不利,导致细胞的存活率降低,这就要求生产中使用的酵母具有适应恶劣环境的能力。因此本实验室利用基因组重排方法对S酵母(Zygosaccharomyces. rouxii)进行基因重排,构建了耐盐菌株S3-2。目前对S酵母耐盐机制的研究尚未完全,因此本文从分子转录水平、基因序列及蛋白质结构进行比对分析及基因过量表达等方而着手,对S和S3-2的耐盐基因GPD1进行研究,为阐明S酵母的耐盐机制奠定基础。本文首先构建测序质粒pUC19-S和pUC19-S3-2,对S和S3-2的GPD1克隆测序。结果发现,相比于S菌株,S3-2的GPD1的碱基发生了突变(ATG起始密码子之前第66bp位置缺失一个碱基A;ORF中第665bp位置上的G突变成A;终止密码子TAA下游第73bp位置上增加了一个G碱基)。而后将测序结果翻译成氨基酸,预测蛋白质的二级、三级结构。分析发现,S和S3-2之间有1个氨基酸发生突变即第223位精氨酸变成赖氨酸(Arg223Lys)。继而从分子转录水平开始研究,通过半定量PCR (RT-PCR)对不同盐浓度下S和S3-2酵母GPD1RNA表达量进行分析。结果表明,S3-2GPD1表达量明显高于SGPD1。最后,构建工程菌株WYS3-2和WYS及对照菌株WY,即将构建的质粒YEp195-S、 YEp495-S3-2和YEp195转入酿酒酵母实验室菌株W303-1A中,并进行一系列指标测定,研究发现,菌株WYS3-2的耐盐性强于WYS,同时又都明显强于对照菌株WY。通过本文的研究表明：S3-2GPD1基因序列中ORF的碱基变化并未导致Gpd1p空间结构的改变,因此S3-2耐渗性高于S菌株与GPD1空间结构无关；启动子和终止子序列的碱基变化是S3-2GPD1基因转录水平提高的重要原因,进而使菌株耐渗性增强；Gpdlp是诱导甘油产生的重要酶,能够提高细胞对外界环境的应答能力。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 前言  9-20
  1.1 酱油发展现状  9-10
    1.1.1 国际酱油发展现状  9-10
    1.1.2 国内酱油发展现状  10
  1.2 酱油高盐稀态发酵  10-12
  1.3 耐盐产香酵母  12-14
    1.3.1 酵母菌在发酵中的作用  12
    1.3.2 耐盐酵母的研究  12-14
  1.4 耐盐基因  14-18
    1.4.1 耐盐基因的研究动态  14-15
    1.4.2 耐盐基因GPD1  15-18
  1.5 本论文研究的目的、意义和主要内容  18-20
2 材料与方法  20-37
  2.1 实验材料  20-24
    2.1.1 菌株与质粒  20-21
    2.1.2 酶与主要试剂  21-22
    2.1.3 仪器与设备  22-23
    2.1.4 溶液与培养基  23-24
  2.2 实验方法  24-37
    2.2.1 引物设计  24-25
    2.2.2 酵母DNA的提取  25
    2.2.3 测序质粒的构建  25-29
    2.2.4 重组质粒pUC19-S-GPD1和pUC19-S3-2-GPD1的鉴定  29
    2.2.5 测序结果与二、三级结构分析  29-30
    2.2.6 RNA提取及反转录  30-31
    2.2.7 表达质粒的构建  31-32
    2.2.8 重组质粒YEp195-S-GPD1和YEp195-S3-2-GPD1转化至酵母W303-1A  32-33
    2.2.9 酵母阳性克隆菌株的鉴定  33-34
    2.2.10 菌株WYS和WYS3-2的比较  34-37
3 结果与讨论  37-60
  3.1 GPD1的测序  37-41
    3.1.1 酵母基因组DNA的提取  37
    3.1.2 GPD1基因PCR产物制备及纯化  37-38
    3.1.3 pUC19质粒的提取  38-39
    3.1.4 PCR产物与pUC19的双酶切  39
    3.1.5 PCR产物与pUC19的连接与转化  39-40
    3.1.6 重组质粒的提取与鉴定  40-41
  3.2 测序结果与结构分析  41-48
    3.2.1 基因测序结果分析  41-43
    3.2.2 Gpd1p蛋白氨基酸序列分析  43-44
    3.2.3 Gpd1p蛋白二、三级结构分析  44-48
  3.3 耐盐基因GPD1在不同菌株中转录水平的比较  48-51
    3.3.1 RNA提取  48-49
    3.3.2 反转录及半定量PCR  49-50
    3.3.3 灰度值比较  50-51
  3.4 酵母工程菌株的构建  51-53
    3.4.1 质粒YEp195提取  51
    3.4.2 质粒YEp195-S-GPD1和YEp195-S3-2-GPD1的构建  51-52
    3.4.3 重组质粒YEp195-S3-2-GPD1和YEp195-S-GPD1的鉴定  52
    3.4.4 重组质粒和空白质粒分别转入酵母W303  52-53
  3.5 Gpd1p蛋白的过量表达  53-60
    3.5.1 耐盐性生长变化  53-55
    3.5.2 抗性变化  55-57
    3.5.3 甘油产量变化  57-58
    3.5.4 Gpd1p的测定  58-60
4 结论  60-61
5 展望  61-62
6 参考文献  62-70
攻读硕士学位期间发表论文情况  70-71
8 致谢  71

相似论文

  1. 大豆疫霉RXLR效应分子靶标的筛选,S435.651
  2. 杏鲍菇（Pleurotus eryngii）漆酶基因的体外诱变及在毕赤酵母中表达,TQ925
  3. 超表达OsSsr1基因烟草的获得及其抗逆性分析,S572
  4. 棉花纤维初始发育期14-3-3相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,S562
  5. 马链球菌兽疫亚种类M蛋白与猪血管内皮细胞互作蛋白筛选,S852.611
  6. 香菇漆酶基因在毕赤酵母中的表达及对三苯甲烷类染料脱色的研究,TQ925
  7. 大豆异黄酮浸种对栽培大豆和滩涂野大豆亲本及其杂交后代幼苗盐害的缓解效应及其机理,S565.1
  8. 产甘油益生菌的分离鉴定及其发酵条件的优化,S823.5
  9. 拮抗酵母菌抑菌机理及对草莓采后冷藏品质影响的研究,S668.4
  10. 金属硫蛋白基因工程菌的构建及其对重金属响应的研究,Q78
  11. 荷花液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆及转基因烟草耐盐性的初步分析,S682.32
  12. 根霉中β-葡萄糖苷酶基因克隆及表达,Q78
  13. hELP3与hELP4、yELP4及CTK1间相互作用的研究,Q75
  14. 牛凝乳酶原基因的定点突变与酶性质研究,Q814
  15. 自身免疫性甲状腺炎早期补硒干预的疗效观察,R581
  16. 大鼠肝癌演进中三种生化因子及相关药物干预的研究,R735.7
  17. 转萝卜过氧化物酶基因RsPrx1酵母表达条件优化及其抗性机理研究,Q943.2
  18. 微水相中脂肪酶手性拆分萘普生,TQ463
  19. 棉粕源酵母发酵饲料的研究,S816
  20. 稀土改性TiO2、多种形貌钨酸锌光催化剂的制备及其性能研究,O643.36
  21. 香蕉皮生物质发酵生产谷胱甘肽研究,TQ936.16

中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 酿造工业 > 调味品的生产 > 常用调味品 > 酱油
© 2012 www.xueweilunwen.com