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茶叶籽蛋白提取及其酶解物抗氧化作用研究

作　者: 冯磊
导　师: 麻成金
学　校: 吉首大学
专　业: 应用化学
关键词: 茶叶籽蛋白提取蛋白酶解物抗氧化作用抗氧化肽
分类号: TS201.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

茶叶籽是茶树(Camellia sinensis O Ktze)的种子,其富含15%左右的蛋白质。目前对于茶叶籽的加工应用主要是茶叶籽和茶皂素的提取,而忽略其中蛋白的开发。茶叶籽蛋白含人体必需氨基酸,具有较高的营养价值及可开发性。本文以茶叶籽为研究材料,采用凯氏定氮法对脱脂茶叶籽粕的蛋白含量进行测定,其蛋白含量为13.48%。分别采用超声波辅助碱法和酶法提取茶叶籽蛋白,对两种方法提取得到纯度较高的茶叶籽蛋白进行水解,筛选出适合的蛋白酶,然后对茶叶籽蛋白的酶解产物进行抗氧化能力试验,研究其抗氧化能力的大小,并采用凝胶柱层析方法对蛋白酶解产物进行初步分离得到抗氧化能力较强的肽片段。主要研究结果如下。用超声波辅助碱法提取茶叶籽蛋白,以蛋白提取率为指标,在单因素的基础上选用料液比、提取液pH、超声波作用温度以及超声波作用时间进行正交试验优化,得到提取茶叶籽蛋白的最佳工艺条件为：料液比为1：25,pH9.5,超声波作用温度为40℃,超声波作用时间为40min。在此优化条件下,蛋白提取率达到79.54%,产品的蛋白纯度为74.76%。试验利用酶法提取茶叶籽蛋白,通过对酶制剂的筛选,得到碱性蛋白酶对茶叶籽蛋白的提取效果最佳。在单因素试验基础上,选择碱性蛋白酶用量、pH值、酶反应时间与温度为试验因素,采用二次通用旋转组合设计试验,优化碱性蛋白酶提取茶叶籽蛋白工艺,以茶叶籽蛋白提取率为评价指标建立回归数学模型,对试验结果进行方差分析及对数学模型进行优化获得茶叶籽蛋白的最佳提取条件。结果表明,酶法提取茶叶籽蛋白的最佳工艺条件为：料液比1：25、碱性蛋白酶用量200U/g、pH10.5、酶反应时间50min、酶反应温度45℃,在此条件下,茶叶籽蛋白提取率可达73.83%,产品的蛋白纯度为79.86%。以酶法提取的茶叶籽蛋白为底物,分别用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶在各自适宜的条件下进行酶解,比较蛋白水解度和酶解物对DPPH自由基的清除作用。结果表明,碱性蛋白酶对茶叶籽蛋白的酶解作用最强,酶解产物清除DPPH自由基效率较高；采用碱性蛋白酶对茶叶籽蛋白进行水解,在单因素试验基础上,响应面设计优化试验得到酶解条件：底物浓度3.4%、加酶量5800U/g、pH8.7、温度57℃、时间4h。该条件下制备的茶叶籽蛋白酶解物对DPPH自由基清除率为85.68%,且测得蛋白水解度为14%。试验测定了茶叶籽蛋白酶解物的抗氧化活性。得到茶叶籽蛋白酶解物的还原能力、自由基清除能力都随着茶叶籽蛋白酶解物浓度的增加而增强,在一定范围浓度范围内呈量效关系。所得茶叶籽蛋白酶解物浓度为2mg/mL时还原能力与0.2mg/mL Vc(抗坏血酸)的还原能力接近；当茶叶籽蛋白酶解物的浓度大于2mg/mL的还原能力高于0.2mg/mLVc的还原能力；茶叶籽蛋白酶解物浓度为10mg/mL时,O2-(对超氧阴离子)自由基、·OH(羟基)自由基以及DPPH(1,1-二苯基苦基苯肼)自由基的清除率分别为66.54%、73.02%和86.34%,其IC50(半抑制浓度)分别为4.83mg/mL,3.28mg/mL,3.17mg/mL。具有抗氧化活性的不同浓度茶叶籽蛋白酶解物通过采用分光光度法在模拟人体胃液条件下测定其清除亚硝酸钠的能力和阻断亚硝胺合成的能力,试验与Vc进行对比。结果表明,茶叶籽蛋白酶解物清除亚硝酸钠的能力及阻断亚硝胺合成的能力与其浓度基本上呈正相关,对亚硝酸钠的清除率可达到79.89%,对亚硝胺合成的阻断率可达到70.97%；通过与Vc的对照、分析,得出茶叶籽蛋白酶解物具有较强的清除亚硝酸钠和阻断亚硝胺合成的能力。利用Sephadex G-25凝胶层析柱将茶叶籽蛋白酶解产物分成三个组分Fra.Ⅰ、 Fra.Ⅱ和Fra.Ⅲ。并分别检测各组分还原能力和对O2-、OH、DPPH三种自由基清除能力。结果表明,Fra. Ⅱ为抗氧化能力最高的组分,对其还原能力的测定得到在700nm处的吸光度为0.195,对O2-、OH、DPPH三种自由基的清除率分别达到21.66%、18.89%、22.24%。

全文目录

摘要  10-12
ABSTRACT  12-14
第1章绪论  14-27
  1.1 茶叶籽综合利用研究概述  14-16
    1.1.1 茶叶籽综合利用研究现状  14-15
    1.1.2 茶叶籽蛋白研究现状  15-16
  1.2 蛋白质的提取方法  16-18
    1.2.1 超声波提取蛋白  16-17
    1.2.2 酶法提取蛋白  17
    1.2.3 水溶液提取蛋白  17
    1.2.4 双水相提取蛋白  17
    1.2.5 反胶团提取蛋白  17-18
  1.3 影响蛋白质提取的因素  18
    1.3.1 pH  18
    1.3.2 温度  18
    1.3.3 盐浓度  18
  1.4 蛋白酶解物研究现状  18-21
    1.4.1 蛋白酶解物的制备  19-21
  1.5 抗氧化作用测定方法  21-23
    1.5.1 还原能力测定  21
    1.5.2 羟基自由基清除能力测定  21-22
    1.5.3 超氧阴离子自由基清除能力测定  22-23
    1.5.4 DPPH自由基清除能力测定  23
  1.6 蛋白酶解物清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成  23
  1.7 蛋白酶解物的分离纯化  23-24
    1.7.1 抗氧化肽的应用前景  24
  1.8 本项目的研究意义  24-25
  1.9 本项目的研究内容和目标  25-27
    1.9.1 主要研究内容  25-26
    1.9.2 研究技术路线图  26
    1.9.3 研究目标  26-27
第2章超声波辅助碱液提取茶叶籽蛋白工艺研究  27-33
  2.1 材料与方法  27-28
    2.1.1 材料与试剂  27
    2.1.2 仪器与设备  27
    2.1.3 研究方法  27-28
  2.2 结果与分析  28-32
    2.2.1 原料中粗蛋白含量测定  28
    2.2.2 茶叶籽蛋白质等电点确定  28-29
    2.2.3 茶叶籽蛋白单因素提取试验  29-30
    2.2.4 超声波提取茶叶籽蛋白工艺优化  30-32
    2.2.5 讨论  32
  2.3 本章小结  32-33
第3章酶法提取茶叶籽蛋白工艺研究  33-44
  3.1 材料与方法  33-35
    3.1.1 材料与试剂  33
    3.1.2 仪器与设备  33
    3.1.3 提取方法  33-34
    3.1.4 茶叶籽蛋白质含量的测定及提取率的计算  34
    3.1.5 酶法提取茶叶籽蛋白质的等电点确定  34
    3.1.6 酶法提取茶叶籽蛋白单因素试验  34-35
    3.1.7 酶法提取茶叶籽蛋白优化试验  35
  3.2 结果与分析  35-43
    3.2.1 酶法提取茶叶籽蛋白等电点确定  35
    3.2.2 酶制剂的确定  35-36
    3.2.3 单因素试验  36-38
    3.2.4 四元二次通用旋转组合设计优化试验  38-43
    3.2.5 讨论  43
  3.3 本章小结  43-44
第4章茶叶籽蛋白酶解物的制备  44-54
  4.1 材料与方法  44-46
    4.1.1 材料与试剂  44
    4.1.2 仪器与设备  44
    4.1.3 研究方法  44-45
    4.1.4 水解度(DH)的测定  45
    4.1.5 平均肽链长(PCL)与平均分子量(Mw)的测定  45-46
    4.1.6 酶解产物抗氧化活性测定  46
    4.1.7 单因素试验  46
    4.1.8 优化试验  46
  4.2 结果与分析  46-53
    4.2.1 蛋白酶的确定  46-47
    4.2.2 单因素试验  47-49
    4.2.3 茶叶籽蛋白酶解工艺参数优化  49-53
    4.2.4 讨论  53
  4.3 本章小结  53-54
第5章茶叶籽蛋白酶解物体外抗氧化作用研究  54-61
  5.1 材料与方法  54-56
    5.1.1 材料与试剂  54
    5.1.2 仪器与设备  54
    5.1.3 研究方法  54-56
  5.2 结果与分析  56-60
    5.2.1 茶叶籽蛋白酶解物还原能力测定  56
    5.2.2 茶叶籽蛋白酶解物清除超氧阴离子自由基能力测定  56-57
    5.2.3 茶叶籽蛋白酶解物清除羟基自由基能力测定  57-58
    5.2.4 茶叶籽蛋白酶解物清除二苯代苦味苯肼自由基(DPPH)能力  58-59
    5.2.5 茶叶籽蛋白酶解物对亚油酸自氧化抑制能力  59
    5.2.6 讨论  59-60
  5.3 本章小结  60-61
第6章模拟胃液条件下茶叶籽蛋白酶解物清除亚硝酸盐及抑制亚硝铵合成的初步研究  61-66
  6.1 材料与方法  61-63
    6.1.1 材料与试剂  61
    6.1.2 仪器与设备  61-62
    6.1.3 研究方法  62-63
  6.2 结果与分析  63-65
    6.2.1 反应条件对试验的影响  63-64
    6.2.2 抗坏血酸(Vc)对清除亚硝酸钠及抑制亚硝胺合成影响  64-65
    6.2.3 讨论  65
  6.3 本章小结  65-66
第7章葡聚糖凝胶层析分离茶叶籽蛋白抗氧化肽  66-71
  7.1 材料与方法  66-67
    7.1.1 材料与试剂  66
    7.1.2 仪器与设备  66
    7.1.3 试验方法  66-67
  7.2 结果与分析  67-70
    7.2.1 茶叶籽蛋白抗氧化肽紫外检测波长的确定  67-68
    7.2.2 茶叶籽蛋白抗氧化活性肽的葡聚糖凝胶G-25分离分析  68
    7.2.3 葡聚糖凝胶G-25分离组分抗氧化活性的测定  68-70
  7.3 本章小结  70-71
全文结论  71-73
参考文献  73-80
作者在学期间取得的学术成果  80-81
附录A 缩略词表  81-82
致谢  82

茶叶籽蛋白提取及其酶解物抗氧化作用研究

内容摘要

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