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斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF50基因的研究

作　者: 闵丹
导　师: 朱越雄；张志芳
学　校: 苏州大学
专　业: 微生物学
关键词: 斜纹夜蛾 昆虫杆状病毒 斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ ORF50 早期基因
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


斜纹夜蛾(Spodoptera litura)属鳞翅目夜蛾科(Lepidoptera: Noctuidae),是严重危害包括水稻、玉米、棉花等共计109科389种农作物的害虫。现发现并鉴定出一种全新的以斜纹夜蛾为特异性宿主的杆状病毒种,命名为斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ(SpltNPVⅡ),其繁殖率和毒性极强,杀虫时间短,而且BV在虫体内的增值速率最快,具有作为生物杀虫剂所具有的优良特性和潜力。本研究主要针对SpltNPVⅡ的ORF50进行研究。斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirusⅡ,SpltNPVⅡ)中的146个开读框(Open Reading Frame,ORF)中,ORF50最为特殊,在国内外均未见研究报道,是新型未知基因。NCBI在线BLAST比对未发现与与ORF50有相似度的基因。将ORF50编码蛋白序列在NCBI数据库中进行在线BLAST比对结果显示,ORF50的编码蛋白序列没有保守序列,目前还没有任何与之相似度大于30%的蛋白序列。本研究通过蛋白质谱分析SpltNPVⅡ的包埋型病毒(occlusionderived virions,ODV)和芽生型病毒(budded virus,BV)组成蛋白差异,结果中均可检测到ORF50的编码蛋白gp50的存在,而且相比较在BVs组成型蛋白中的gp50存在检测分值要比ODV中高,因为SpltNPVⅡ的BV在虫体内的增值速率最快,推测gp50可能与BV在虫体内对周围细胞的感染有着重要作用。以pGL3-Basic对ORF50的前导序列50P进行启动子活性分析,在未加诱导因子的情况下,重组载体能够顺利表达萤光素酶,在荧光底物的存在下,能够产生荧光,而且其光量子强度均值达到18456,与阴性对照217差异极大,由此可以确定50P启动子为SpltNPVⅡ的早期启动子。分别合成各感染时相cDNA,以引物50P1:5’ttgaaagacgacggtgtgt3’,50P2:5’ctattcgacatgagcaacaatctg3’,25μL反应体系进行RT-PCR检测,结果显示,ORF50在2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h均有转录。根据目的基因序列设计引物,50P3:5’-gtcgatgaagaggtctggcaatac-3’;50P4:5’-ctcttcgttcataatcatgtcgtgc-3’,以提取RNA稀释到等量作为本底参照,进行荧光定量PCR分析,结果与RT-PCR一致。以等量的各个时期的总蛋白为抗原,豚鼠面议纯化蛋白为一抗,羊抗豚鼠抗原为二抗,进行蛋白免疫印迹(western blotting)检测表达时相分析,结果发现2 h、4 h、12 h、24 h、36 h、48 h等时相总蛋白中均能够检测到ORF50编码蛋白gp50的存在。结合RT-PCR,荧光定量PCR、蛋白免疫印迹(western blotting)检测表达时相分析,均能够确定ORF50在病毒感染2 h后开始转录表达,进一步表明该基因是一个早期基因。有关研究为深入分析SpltNPVⅡ的ORF50功能奠定了基础。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-13
第一部分 文献综述  13-25
  第一章 斜纹夜蛾与杆状病毒研究进展  13-25
    1.1 农林害虫斜纹夜蛾  13-15
      1.1.1 农林害虫斜纹夜蛾的习性特征  13-14
      1.1.2 斜纹夜蛾对农业生产的危害  14
      1.1.3 农业害虫的治理  14-15
    1.2 生物防治  15-16
      1.2.1 利用害虫天敌防治害虫  15
      1.2.2 利用作物对病虫害的抗性防治  15
      1.2.3 利用病原微生物防治害虫  15-16
    1.3 昆虫杆状病毒  16-25
      1.3.1 昆虫杆状病毒分类与命名  16-17
      1.3.2 杆状病毒的感染周期  17-18
      1.3.3 杆状病毒基因组  18-21
      1.3.4 昆虫杆状病毒的应用  21-25
第二部分 实验研究报告  25-84
  第二章 研究意义及研究方案  25-31
    2.1 立题依据和意义  25-29
      2.1.1 SpltNPVⅡ的基因组分析  25-27
      2.1.2 SpltNPVⅡ的ORF50 序列分析  27-29
    2.2 研究方案  29-30
    2.3 主要研究路线  30-31
  第三章 实验材料与方法  31-50
    3.1 实验材料  31-38
      3.1.1 材料  31
      3.1.2 工具酶及Kit  31-32
      3.1.3 主要实验试剂与配制  32-38
    3.2 常用实验仪器设备  38-39
    3.3 实验方法  39-50
      3.3.1 SpltNPVⅡODVs 组成蛋白样品的制备  39
      3.3.2 SpltNPVⅡBVs 组成蛋白样品的制备  39
      3.3.3 SpltNPVⅡ基因组DNA 的提取  39-40
      3.3.4 基因片段的PCR 扩增  40-41
      3.3.5 玻璃奶法纯化回收DNA 片段  41
      3.3.6 DNA 片段与载体连接  41
      3.3.7 E.coli 热激感受态细胞的小量制备  41-42
      3.3.8 质粒DNA 或连接产物的热转化  42
      3.3.9 重组质粒的鉴定  42-43
      3.3.10 碱法少量快速抽提质粒DNA  43
      3.3.11 DNA 和RNA 浓度测定  43
      3.3.12 酶切  43
      3.3.13 菌种保存  43
      3.3.14 重组表达菌的诱导表达  43-44
      3.3.15 融合表达蛋白的鉴定  44
      3.3.16 BL21 的IPTG 诱导大量表达  44
      3.3.17 包涵体蛋白的洗涤与变性溶解  44
      3.3.18 Ni 柱纯化His Tag 蛋白  44-45
      3.3.19 Bradford 法测定蛋白浓度  45
      3.3.20 Ni+-NTA 树脂的再生  45-46
      3.3.21 ELISA 酶联免疫吸附测定：间接法测定效价  46
      3.3.22 酶联免疫吸附测定（Western blotting）  46-47
      3.3.23 萤光素酶标记的启动子活性分析  47
      3.3.24 利用Trizol 抽提组织总RNA  47-48
      3.3.25 RT-PCR  48-49
      3.3.26 荧光定量PCR（Realtime Quantitative PCR）  49-50
  第四章 SpltNPVⅡODVs 与BVs 组成型蛋白比较分析  50-55
    4.1 引言  50-51
    4.2 材料与方法  51-52
      4.2.1 SpltNPVⅡ病毒  51
      4.2.2 实验试剂  51
      4.2.3 实验方法  51-52
    4.3 结果与分析  52-54
      4.3.1 SDS-PAGE 结果  52-53
      4.3.2 质谱分析  53-54
    4.4 讨论  54-55
  第五章 SpltNPVⅡORF50 基因的的克隆与表达  55-61
    5.1 引言  55
    5.2 材料与方法  55-57
      5.2.1 实验材料  55-56
      5.2.2 实验方法  56-57
    5.3 结果与分析  57-60
      5.3.1 PCR 扩增与TA 克隆  57-58
      5.3.2 重组表达载体的构建及鉴定  58-59
      5.3.3 重组质粒在大肠杆菌中诱导融合表达  59-60
    5.4 讨论  60-61
  第六章 gp50 蛋白的纯化及其抗体的制备  61-69
    6.1 引言  61
    6.2 材料与方法  61-63
      6.2.1 实验材料  61
      6.2.2 实验方法  61-63
    6.3 结果与分析  63-68
      6.3.1 Ni+-NTA 树脂蛋白纯化结果及分析  63-64
      6.3.2 纯化蛋白的质谱分析鉴定  64-65
      6.3.3 Bradford 法测定浓缩纯化蛋白浓度  65-66
      6.3.4 gp50 抗体的制备与鉴定  66-68
    6.4 讨论  68-69
  第七章 SpltNPVⅡORF50 基因的启动子活性分析  69-75
    7.1 引言  69
    7.2 材料与方法  69-71
      7.2.1 实验材料  69-70
      7.2.2 实验方法  70-71
    7.3 结果与分析  71-73
      7.3.1 pMD18T-50P 克隆载体的构建与DNA 测序鉴定  71-72
      7.3.2 启动子分析载体pGL3-Basic-50P 的构建及鉴定  72
      7.3.3 SpltNPVⅡORF50 基因的启动子基因50P 活性分析  72-73
    7.4 讨论  73-75
  第八章 SpltNPVⅡORF50 基因的时相转录表达分析  75-82
    8.1 引言  75
    8.2 材料与方法  75-77
      8.2.1 感染病毒的细胞与虫体分时相收取  75-76
      8.2.2 组织总RNA 抽提  76
      8.2.3 RT-PCR  76
      8.2.4 荧光定量PCR（Real time Quantitative PCR）  76-77
      8.2.5 Western blotting 时相分析  77
    8.3 结果与分析  77-81
      8.3.1 RT-PCR 时相分析  77
      8.3.2 荧光定量PCR 时相分析  77-81
      8.3.3 蛋白免疫印迹检测表达时相分析  81
    8.4 讨论  81-82
  第九章 全文总结  82-84
    9.1 斜纹夜蛾与杆状病毒  82
    9.2 斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ及其ORF50  82-83
    9.3 ORF50 的转录表达时相分析  83
    9.4 有待进一步研究内容  83
    9.5 结束语  83-84
参考文献  84-90
附录  90-96
  1 研究所用载体图谱  90-92
  2 测序图谱  92-96
缩略语表  96-97
在读期间发表论文  97-98
致谢  98-99

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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