学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

脲对棒酸合成影响及棒酸高通量显色检测方法

作　者: 戴西达
导　师: 高强
学　校: 天津科技大学
专　业: 发酵工程
关键词: 棒酸脲脲酶头孢硝噻吩显色法棒状链霉菌
分类号: TQ920
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 1次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

棒酸(Clavulanic acid)是棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的p-内酰胺酶抑制剂,其合成过程中产生副产物脲。为了探讨脲对棒酸合成的影响,进行了添加脲的发酵实验,低浓度脲降低棒酸产量,当添加脲浓度达到20mmol/I时,完全抑制棒酸合成。由于脲酶可以水解脲形成铵离子,导致铵离子浓度及pH.提高,因此,通过阻断棒状链霉菌脲酶活性,可以更准确反映脲对棒酸合成的影响。结果发现,脲酶失活株发酵液中积累大量脲,浓度高达10mmol/L,但棒酸产量没有明显降低,说明在该浓度下脲自身并不能抑制棒酸合成。添加脲降低野生菌棒酸产量,可能是脲被水解为铵离子或其引起的pH变化所致。而棒酸发酵液添加铵盐的结果显示铵离子对棒酸产量没有抑制作用,另外pH梯度实验证实pH对棒酸产量影响较大。因此,脲添加导致野生菌棒酸产量降低的原因是脲酶水解脲导致pH提高,加速了棒酸降解所致,这与已有的报道一致。本研究排除了脲和铵离子对棒酸合成的抑制作用,证实了pH对棒酸产量的关键作用,为进一步阐明棒酸合成调控机制提供了根据。另外,为了满足从棒状链霉菌突变库中筛选棒酸高产株的需求,我们设计了一种快速显色检测棒酸含量的方法。该方法是基于β-内酰胺酶水解其黄色底物头孢硝噻吩(λmax=390nm)生成红色产物(λmax=486nm)的反应。由于棒酸是β-内酰胺酶不可逆抑制剂,在上述反应中棒酸含量的高低影响底物和产物的量,因此可以通过测定底物和产物的量(OD390/OD486比值)最终测定棒酸的含量。实验证实,该方法对棒酸的灵敏度为50μg/L,最佳检测窗口为0.05～10mg/L,且该方法的检测结果与HPLC法的结果相关性很好。通过筛选一个小规模棒状链霉菌突变株库发现,该显色法可以快速识别和评价棒酸高产突变株,能为大规模突变株筛选工作节省大量的时间与人力。另外,我们还利用该显色反应,直接根据颜色差异定性的判断平板菌落棒酸产量高低。该显色法是一种快速、方便、可靠的棒酸产量检测方法,适合于高通量筛选棒酸高产株。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
目录  6-9
1 前言  9-22
  1.1 链霉菌概述  9
  1.2 棒酸简介  9-10
  1.3 棒酸稳定性  10
  1.4 棒酸合成基因簇及生物合成途径  10-13
  1.5 氮代谢  13-17
    1.5.1 氮代谢同化  13-14
    1.5.2 氮代谢调控  14-15
    1.5.3 精氨酸代谢  15-17
  1.6 氮代谢调节抗生素的产生  17-19
  1.7 氮源对棒酸合成影响  19
  1.8 高通量检测棒酸  19-20
  1.9 研究目的及意义  20-22
2 材料与方法  22-31
  2.1 材料  22-25
    2.1.1 菌株、质粒及引物  22-23
    2.1.2 培养基  23-24
    2.1.3 实验试剂  24-25
    2.1.4 实验仪器  25
  2.2 实验方法  25-31
    2.2.1 常规培养  25
    2.2.2 大肠杆菌质粒提取  25-26
    2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA转化  26
    2.2.4 链霉菌基因组DNA的提取  26
    2.2.5 接合转移法将质粒导入链霉菌  26-27
    2.2.6 脲酶缺失株的构建  27-28
    2.2.7 棒酸发酵  28
    2.2.8 棒酸高效液相色谱检测  28-29
    2.2.9 生物量检测  29
    2.2.10 铵离子含量检测  29
    2.2.11 脲酶活性及脲含量检测  29
    2.2.12 双报告突变株筛选  29
    2.2.13 β-内酰胺酶粗酶液制备及酶活测定  29-30
    2.2.14 高通量显色法检测棒酸  30
    2.2.15 高通量显色法检测棒酸敏感性  30-31
3 结果与讨论  31-45
  3.1 脲对棒酸合成影响实验结果  31-38
    3.1.1 基础实验  31-33
    3.1.2 脲添加对野生菌株S. clavuligerus NRRL 3585合成棒酸影响  33
    3.1.3 棒状链霉菌脲酶敲除株构建及发酵  33-37
    3.1.4 铵盐添加对棒酸产量影响  37
    3.1.5 不同pH对棒酸产量影响  37-38
  3.2 高通量显色检测棒酸实验结果  38-42
    3.2.1 β-内酰胺酶粗酶液酶活性  38-39
    3.2.2 高通量显色法检测棒酸标准曲线  39-40
    3.2.3 高通量显色法筛选突变株：出发菌株与双报告突变株棒酸产量比较  40-41
    3.2.4 高通量显色法检测3株高产株棒酸产量时间曲线  41-42
    3.2.5 高通量显色法裸眼检测棒酸  42
  3.3 讨论  42-45
    3.3.1 脲对棒酸产量影响讨论  42-43
    3.3.2 高通量显色法检测棒酸讨论  43-45
4 结论  45-46
5 展望  46-47
6 参考文献  47-55
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  55-56
8 致谢  56

脲对棒酸合成影响及棒酸高通量显色检测方法

内容摘要

全文目录

相似论文