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南海微藻的分离、鉴定及脂肪酸特性分析

作　者: 宗娜娜
导　师: 李峰
学　校: 青岛科技大学
专　业: 化学工程
关键词: 能源微藻 18S rDNA BODIPY 梅尼小环藻培养条件
分类号: TE667
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

随着全球经济的快速发展,能源危机和环境危机也日益严重。微藻光合效率高、生长速度快、含油量高,已被公认为生产生物柴油的优质原料。然而,微藻的生物多样性高,目前已有3万株微藻被报道,如何从这个庞大的体系中筛选出适合产业化生产生物柴油的优质藻种,成为进行其他研究方向的基础。中国四季分布明显,我们必须寻找适当的藻种,来适应不同的生长温度,以实现微藻生物柴油原料的稳定供应。南海生物多样性高,多为暖水种,从南海海域采集微藻样品进行分离纯化,以期得到一株含脂量高,生长速度快,耐受高温的能源微藻,从而实现微藻生产生物柴油的产业化生产。1、通过微吸管分离法对南海的样品进行分离纯化,共得到纯化微藻12株。对纯种藻株进行扩大培养,用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA,用PCR技术扩增其18S rDNA,对序列进行测序,在CNBI进行序列比对分析,从而实现分子生物学的鉴定,同时结合光学显微镜、扫描电镜和透射电镜进行形态学分析,鉴定出所分离12株藻株,通过分子生物学和形态学鉴定相结合的方法,大大增加了微藻鉴定的准确性。2、对南海中分离纯化的12株微藻进行总脂含量、生物量及脂肪酸组成进行分析。由生长曲线可知,这12株微藻全部长势良好。通过甲醇-氯仿(2：1)重量法对12株微藻中的总脂含量进行测定,其中含油量最高的微藻是梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana),总脂含量为39.95%,生物量为2.8535g/L,最终获得生物量最大的微藻为微拟球藻(Nannochloropsis salina),总脂含量为23.46%,生物量为4.3969g/L。两株微藻生长速度快,含油量高,是生产微藻生物柴油的优良藻种。将从微藻提取的粗油脂经过甲酯化反应后,通过气相色谱技术,对其脂肪酸组分进行分析,所有微藻内长链(14C以上)脂肪酸占总脂含量均在80%以上。结果表明,不同门类的微藻中脂肪酸组成差异较大。金藻中主要脂肪酸种类为：C18:1、C14:0、C18:3和C16:0, DHA含量为8.19%；绿藻中C16：0、C16：1、C18：1含量较高,其他种类脂肪酸分布较分散,含量较低；硅藻中C14:0、C16:O、C16:1、C22:4含量较高,脂肪酸种类比较集中,除茧形藻外都含少量DHA。3、通过单因子实验探讨了温度、光照、营养盐浓度对梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)生长及油脂积累的影响,同时建立了通过BODIPY染色快速测定微藻内粗油脂含量的方法。由实验可知,梅尼小环藻(在接种10d左右达到平台期,生长周期较短,适合微藻制备生物柴油的产业化生产。生物量和油脂含量是衡量微藻能否作为生物柴油原料的两个关键因素,综合两方面考虑,梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)最适培养条件为：温度25℃、光照强度25001ux、氮浓度75g/L、磷浓度120g/L、硅浓度15g/L、铁浓度12.6g/L。实验证明,优化培养条件是获得高产量、高质量微藻的重要途径。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
第一章引言  10-31
  1.1 生物柴油  10-11
  1.2 微藻生物柴油  11-14
    1.2.1 微藻生物柴油的应用  11-12
    1.2.2 微藻生物柴油的优缺点  12-14
    1.2.3 微藻制备生物柴油的研究进展  14
  1.3 能源微藻  14-16
    1.3.1 微藻的分离方法  15-16
      1.3.1.1 微吸管分离法  15
      1.3.1.2 稀释分离法  15
      1.3.1.3 水滴分离法  15-16
      1.3.1.4 抗生素分离法  16
      1.3.1.5 平板分离法  16
  1.4 18S rDNA在分子生物学鉴定中的应用  16-17
  1.5 微藻生长及油脂含量的影响因素  17-21
    1.5.1 环境因子的影响  18-19
    1.5.2 营养盐组成的影响  19-20
    1.5.3 培养方式的影响  20-21
  1.6 BODIPY染色法在富油微藻筛选中的应用  21-24
    1.6.1 BODIPY染料概述  21-22
    1.6.2 微藻油脂测定几种方法的比较  22-24
      1.6.2.1 铜试剂法  22-23
      1.6.2.2 在线气质联用法  23
      1.6.2.3 傅立叶变换红外光谱法  23
      1.6.2.4 尼罗红染色法  23-24
      1.6.2.5 BODIPY染色法  24
  1.7 立题依据  24-25
  参考文献  25-31
第二章南海中微藻的分离纯化及鉴定  31-43
  2.1 引言  31-32
  2.2 实验部分  32-35
    2.2.1 试剂  32
    2.2.2 仪器和设备  32
    2.2.3 藻株的分离纯化及培养  32-34
    2.2.4 微藻18S rDNA分子生物学鉴定  34
      2.2.4.1 微藻总DNA的提取  34
      2.2.4.2 微藻18S rDNA基因PCR扩增  34
    2.2.5 微藻形态学鉴定  34-35
      2.2.5.1 通过扫描电镜对微藻进行形态学分析  34
      2.2.5.2 通过透射电镜对微藻进行形态学分析  34-35
  2.3 结果与讨论  35-40
    2.3.1 微藻总DNA提取电泳检测  35-36
    2.3.2 PCR扩增产物电泳检测  36
    2.3.3 核酸序列测定、比对结果  36-37
    2.3.4 微藻形态学鉴定  37-40
  2.4 本章小结  40-41
  参考文献  41-43
第三章富油微藻的筛选及其脂肪酸特性分析  43-55
  3.1 引言  43
  3.2 实验部分  43-46
    3.2.1 试剂  43-44
    3.2.2 仪器与设备  44
    3.2.3 藻种及来源  44
    3.2.4 微藻的大量培养及生长曲线的绘制  44
    3.2.5 微藻的收集及生物量的测定  44-45
    3.2.6 甲醇-氯仿法测定微藻粗油脂含量  45
    3.2.7 微藻总脂计算公式  45
    3.2.8 气相色谱法对微藻进行油脂特性分析  45-46
  3.3 结果与讨论  46-53
    3.3.1 粗油脂的测定结果  46-47
    3.3.2 金藻的生长曲线及油脂特性分析  47
    3.3.3 绿藻的生长曲线油脂特性分析  47-50
    3.3.4 6株硅藻的生长曲线及油脂特性分析  50-53
  3.4 本章小结  53-54
  参考文献  54-55
第四章不同环境因子对梅尼小环藻生长及产油的影响  55-72
  4.1 引言  55-56
  4.2 实验部分  56-58
    4.2.1 试剂  56
    4.2.2 实验仪器及设备  56
    4.2.3 藻种接种及前处理  56-57
    4.2.4 微藻细胞密度的测定  57
    4.2.5 不同营养盐浓度对梅尼小环藻生长的影响  57
    4.2.6 不同温度光照强度对梅尼小环藻生长的影响  57
    4.2.7 生物量的测定  57-58
  4.3 结果与讨论  58-68
    4.3.1 用BODIPY染色梅尼小环藻  58-59
    4.3.2 温度对梅尼小环藻生长及油脂含量的影响  59-60
    4.3.3 光照对梅尼小环藻生长及油脂含量的影响  60-62
    4.3.4 氮浓度对梅尼小环藻生长及油脂含量的影响  62-63
    4.3.5 磷浓度对梅尼小环藻生长及油脂含量的影响  63-65
    4.3.6 硅浓度对梅尼小环藻生长及油脂含量的影响  65-67
    4.3.7 铁浓度对梅尼小环藻生长及油脂含量的影响  67-68
  4.4 本章小结  68-69
  参考文献  69-72
结论  72-74
致谢  74-75
发表的学术论文  75-76

南海微藻的分离、鉴定及脂肪酸特性分析

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