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高效毛细管电泳酶抑制剂筛选方法研究

作　者: 张文慧
导　师: 吕志华
学　校: 中国海洋大学
专　业: 药物化学
关键词: 酪氨酸酶二肽基肽酶抑制剂毛细管电泳
分类号: R917
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

在已经上市的药物当中，以酶为靶点的药物所占的比例高达五分之一，且当今社会威胁人类生命健康的几大主要疾病如肿瘤、糖尿病等都与酶的失调有重大关系，因此酶抑制剂的研发对于新药研究有重要意义。目前常用的筛选酶抑制剂的方法有分光光度法、酶标仪法等，分光光度法不能避免复杂基质的影响，酶标仪法因采用微孔板等耗材成本太高，而毛细管电泳具有高效、快速、试剂消耗量少等优点，本论文意在通过高效毛细管电泳进行酶抑制剂的研究，将其发展成为简便可靠的高通量筛选平台，来用于创新药物的研究开发。第一部分建立了一种新型的毛细管柱中在线反应方法，以HDB作为离子键合剂构建毛细管电泳固定化酶微反应器，来筛选酪氨酸酶抑制剂。实验过程中采用L-酪氨酸作为底物，考察了微反应器的稳定性为10次左右，优化了孵育时间为2min，测定了酪氨酸酶酶活常数-米氏常数Km为0.5334mM，测定了阳性对照剂曲酸对游离酶的抑制常数为22.54uM，并确定了其抑制类型为混合型抑制，证实了该模型的可行性，并对18种金属配合物和13种中草药的粗提物进行了活性筛选，其中独活和知母对酪氨酸酶有一定的抑制活性，抑制率依次为29.51%和47.34%。第二部分首次采用毛细管柱前反应法来筛选二肽基肽酶抑制剂，实验采用甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）为底物，实验过程中优化了底物和产物的分离条件、底物和酶的反应条件，最终确定最优条件为分离条件：运行缓冲液10mM NaH₂PO₄+10mM SDS pH7.5，温度37℃，运行电压30Kv，柱长40cm；反应条件：85μL10mM NaH₂PO₄pH7.5+10μL底物溶液+5μL酶溶液，反应时间40min，检测波长214nm和405nm。测定了二肽基肽酶的酶活性常数-米氏常数0.3708mM，阳性对照剂-西他列汀对游离酶的抑制常数为1.2169mM，并确定了西他列汀的抑制类型为混合型抑制，证实了该方法的可行性，并对50种天然产物粗提物和16种化合物进行了活性筛选，筛选出有活性的天然产物粗提物一个TN-LGQ-94，抑制率为63.29%，化合物四个Sun-3.2、 Gfm-0429、Gfm-0430、Gfm-0504，抑制率分别为56.98%、65.32%、48.61%、60.58%。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-8
目录  8-11
第一章前言  11-29
  1.1 酶促反应动力学及其抑制动力学原理  11-16
    1.1.1 米氏常数的意义及其计算原理  11-13
    1.1.2 酶的抑制动力学  13-16
  1.2 酶抑制剂的筛选方法  16-18
    1.2.1 酶抑制剂源  16
    1.2.2 酶抑制剂的筛选方法  16-18
  1.3 毛细管电泳在筛选酶抑制剂中的应用  18-23
    1.3.1 柱前反应测定  19-20
    1.3.2 柱中反应测定  20-23
    1.3.3 柱后反应测定  23
  1.4 酪氨酸酶和二肽基肽酶抑制剂的研究概况  23-28
    1.4.1 酪氨酸酶抑制剂的研究概况  23-25
    1.4.2 二肽基肽酶抑制剂的研究状况  25-28
  1.5 论文研究目的  28-29
第二章高效毛细管电泳对酪氨酸抑制剂的筛选研究  29-41
  2.1 引言  29-30
  2.2 实验材料  30-31
    2.2.1 实验试剂  30
    2.2.2 实验仪器  30-31
  2.3 实验步骤  31-33
    2.3.2 毛细管柱的维护  31
    2.3.3 毛细管固定化酶微反应器的制备方法  31-33
    2.3.4 电泳条件  33
  2.4 结果与讨论  33-40
    2.4.1 固定化酶微反应器稳定性考察  33
    2.4.2 孵育时间的优化  33-34
    2.4.3 酪氨酸酶米氏常数的测定  34
    2.4.4 曲酸抑制机制的研究  34-37
    2.4.5 酪氨酸酶抑制剂活性筛选  37-40
  2.5 小结  40-41
第3章毛细管电泳筛选二肽基肽酶方法研究  41-57
  3.1 引言  41-42
  3.2 实验材料  42
    3.2.1 实验试剂  42
    3.2.2 实验仪器  42
  3.3 实验步骤  42-44
    3.3.1 溶液配制  42-43
    3.3.2 毛细管柱的维护  43
    3.3.3 实验步骤  43-44
  3.4 结果与讨论  44-56
    3.4.1 优化 SDS 浓度  44
    3.4.2 优化柱子长度  44-45
    3.4.3 优化反应缓冲液的种类  45-46
    3.4.4 优化酶量  46-47
    3.4.5 优化反应体系 pH  47
    3.4.6 优化反应时间  47-48
    3.4.7 精密度的考察  48-49
    3.4.8 二肽基肽酶米氏常数的测定  49
    3.4.9 西他列汀抑制机制的研究  49-52
    3.4.10 二肽基肽酶抑制剂活性的筛选  52-56
  3.5 小结  56-57
第四章结论  57-58
参考文献  58-64
致谢  64-65
个人简历  65-66
发表的学术论文  66-67

高效毛细管电泳酶抑制剂筛选方法研究

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