学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

酿酒酵母以甘油为碳源发酵生产乙醇的研究

作　者: 潘晓睿
导　师: 马平生
学　校: 天津大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 酿酒酵母甘油乙醇 noxE DAK1 DAK2 GCY1
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 89次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

化石能源作为一种有限的不可再生资源,在人类持续、大量开采使用下,必然面临枯竭,为从根本上解决化石能源危机,生物乙醇作为替代能源得到了蓬勃发展。由于目前国际粮食价格飞涨,用粮食生产乙醇会引发粮食危机。与粮食吃紧形成鲜明对比的是生物柴油生产过程中会产生10%的主要副产物甘油,然而这些过量的甘油却会成为环境隐患。这些甘油的一个可能的应用前景是将其作为微生物生长所必需的碳源以生产高附加值的化工产品。以甘油为底物生产生物乙醇,能同时解决粮食紧张和甘油过剩两个问题。本实验室在前期研究工作中已经构建了编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因GPD1、GPD2双缺失的LGE4酵母工程菌株,在利用甘油为碳源生产乙醇的过程中不会有副产物甘油产生,为本课题研究建立了基础。由于LGE4菌株中甘油代谢支路被阻断,细胞内氧化还原平衡遭到了破坏——产生过剩的NADH,严重影响菌株生长状况。为此本课题在LGE4菌株中表达编码NADH氧化酶的noxE基因,构建出菌株LGE4-N。NADH氧化酶可以在有氧的条件下氧化NADH生成H2O,维持胞内氧化还原平衡,从而改善了菌株生长状况。在LGE4-N生长改善的基础上过量表达编码甘油脱氢酶的GCY1基因以及编码磷酸二羟丙酮的DAK1、DAK2基因,这些基因的编码产物催化甘油到磷酸二羟丙酮的代谢,是以甘油为底物生产乙醇的重要环节。首先分别在YCplac33和YEplac195质粒上构建用PGK1的启动子表达GCY1、DAK1、DAK2的质粒;然后在整合了noxE基因的菌株LGE4-N中分别转化过量表达GCY1、DAK1、DAK2基因的质粒以及YCplac33和YEplac195质粒作对照,在以甘油为碳源的培养基上考察菌株的生长情况。实验结果表明,过量表达GCY1、DAK1、DAK2基因对菌株LGE4-N在甘油培养基中的生长代谢情况有很大的改善,为甘油为底物生产乙醇提供了支持。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
前言  9-10
第一章文献综述  10-19
  1.1 生物乙醇  10-12
    1.1.1 生物乙醇是生物质能源的一种  10
    1.1.2 生物乙醇对化石能源的替代作用  10-11
    1.1.3 生物乙醇的发展现状  11
    1.1.4 量产生物乙醇面临的问题  11-12
  1.2 以甘油为底物生产乙醇  12-14
    1.2.1 甘油是生物柴油生产中的副产物  12
    1.2.2 利用甘油生产乙醇的必要性  12
    1.2.3 利用甘油生产乙醇的可行性  12-14
  1.3 noxE基因编码的过氧化物酶对NADH的氧化  14-15
    1.3.1 酿酒酵母细胞中甘油的重要作用  14-15
    1.3.2 noxE基因对NADH的氧化作用  15
  1.4 甘油吸收利用过程中的关键基因DAK1 DAK2 GCY1  15-18
    1.4.1 甘油副产物的产生  16
    1.4.2 甘油和乙醇代谢通路的转换  16
    1.4.3 编码甘油脱氢酶的基因GCY1  16-17
    1.4.4 DAK1、DAK2 基因对于利用甘油生产乙醇的作用  17-18
  1.5 本课题的研究背景、内容和目的  18-19
第二章实验材料及方法  19-33
  2.1 实验材料  19-26
    2.1.1 菌株、质粒与引物  19-21
    2.1.2 主要仪器  21-22
    2.1.3 主要试剂  22-23
    2.1.4 培养基  23-24
    2.1.5 主要溶液  24-26
  2.2 实验方法  26-33
    2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  26
    2.2.2 小规模提取大肠杆菌质粒法（CTAB法）  26-27
    2.2.3 酵母染色体的快速分离  27
    2.2.4 PCR扩增反应  27-28
    2.2.5 DNA的限制酶消化  28-29
    2.2.6 DNA的连接反应  29
    2.2.7 DNA的琼脂糖凝胶电泳  29
    2.2.8 酵母细胞的转化  29-30
    2.2.9 两步基因置换法修饰目的基因  30-31
    2.2.10 生长曲线的测量  31-33
第三章结果与讨论  33-55
  3.1 noxE基因对LGE4 菌株生长的影响  33-37
    3.1.1 YCplac33-PGK1t-noxE质粒的构建  33-35
    3.1.2 YCplac33-GPD1p-noxE-PGK1t质粒的构建  35
    3.1.3 表达noxE对出发菌株LGE4 生长的影响  35-37
      3.1.3.1 CM-URA3 平板上的生长状况比较  35-36
      3.1.3.2 CM-URA3 液体培养基中的生长状况比较  36-37
  3.2 在菌株LGE4 中整合noxE基因  37-43
    3.2.1 YIplac211-GPD1pt-noxE质粒的构建  38-39
    3.2.2 菌株LGE4 中noxE基因的整合  39-41
    3.2.3 整合noxE基因的LGE4-N菌株生长状况  41-43
      3.2.3.1 菌株LGE4 和LGE4-N在YPD平板上的生长状况比较  41-42
      3.2.3.2 菌株LGE4 和LGE4-N在在YPD液体培养基中的生长状况比较  42-43
  3.3 过量表达DAK1 DAK2 GCY1 质粒的构建  43-49
    3.3.1 YCplac33-PGK1p质粒的构建  43-44
    3.3.2 YEplac195-PGK1p质粒的构建  44-45
    3.3.3 YCplac33-PGK1p-DAK1 质粒的构建  45-46
    3.3.4 YCplac33-PGK1p-DAK2 质粒的构建  46
    3.3.5 YCplac33-PGK1p-GCY1 质粒的构建  46-47
    3.3.6 YEplac195-PGK1p-DAK1 质粒的构建  47-48
    3.3.7 YEplac195-PGK1p-DAK2 质粒的构建  48
    3.3.8 YEplac195-PGK1p-GCY1 质粒的构建  48-49
  3.4 在LGE4-N菌株中过表达DAK1、DAK2、GCY1 基因  49-55
    3.4.1 在CM- URA3 平板培养基上考察各质粒对菌体生长的影响  49-51
    3.4.2 在CM-URA3+gly平板培养基上考察各质粒对菌体生长的作用  51-52
    3.4.3 在CM-URA3+gly液体培养基中考察各质粒对菌体生长的影响  52-55
第四章总结与展望  55-57
  4.1 工作总结  55
  4.2 工作展望  55-57
参考文献  57-62
附录1 生化名词缩写  62-63
附录2 基因及其相应编码产物  63-64
致谢  64

酿酒酵母以甘油为碳源发酵生产乙醇的研究

内容摘要

全文目录

相似论文