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转基因家蚕/细胞表达hGM-CSF和绿色荧光蚕丝的制备

作　者: 陈慧梅
导　师: 贡成良
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕基因打靶 hGM-CSF 荧光蚕丝转化细胞
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

人粒-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor ,hGM-CSF)是一造血刺激因子,能够刺激T细胞和巨噬细胞增殖、成熟和分化,提高机体免疫力,具有十分重要的临床应用价值,在国际生物技术制药市场上也占有重要的位置。家蚕(Bombyx mori)属于鳞翅目蚕蛾科,能大规模饲养,遗传背景比较清楚,其丝腺具有强大合成和分泌丝蛋白的能力。为探讨在家蚕丝腺特异性表达hGM-CSF的可能性,以家蚕丝素轻链基因(fib-L)组序列为左(约1.2kb)、右(约0.5kb)同源臂,用丝素重链基因(fib-H)启动子控制hGM-CSF基因,家蚕肌动蛋白A3启动子控制GFP报告基因,构建了轻链基因打靶载体pSK-FibL-L-A3GFP-PH-GMCSF-LPA-FibL-R;通过精子介导法将该载体导入初产卵,首先在G0代通过绿色荧光筛选荧光蚕,由PCR和DNA杂交结果证实所筛选出的荧光蚕为转基因家蚕;western blot检测结果显示,在G3代后部丝腺组织中可检测到分子量为22 kDa的hGM-CSF特异性条带;ELISA分析结果显示,hGM-CSF在转基因后部丝腺组织的表达水平为2 700 pg/g冻干粉。表明通过基因打靶可以将外源基因导入希望的家蚕基因组位点,并实现表达。缺失丝素轻链基因的第6外显子第30核苷酸下游区域不影响家蚕的吐丝结茧。为了能通过遗传分子来改造家蚕丝,本研究构建轻链基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R,以丝素蛋白轻链基因组终止密码TAA上游1.2 kb和TAA下游0.5 kb左右的片段为同源臂,将绿色荧光蛋白(GFP)基因的DNA序列克隆进二同源臂之间,使GFP基因的读码框与丝素蛋白轻链基因的读码框一致,转基因载体通过精子介导法将该载体导入初产卵,并结合分子生物学检测,获得了能吐绿色荧光丝的基因打靶蚕。有关结果为分子设计改变蚕丝的性状奠定了基础。另外,我们建立了非转座子载体介导的持续表达外源基因的转化家蚕BmN细胞系,我们将家蚕核型多角体病毒极早期基因(ie-1)启动子控制的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的表达盒克隆进pIZT/V5-His获重组pIZT-IE-hGM-CSF,该载体转染家蚕BmN细胞后,通过博莱霉素(zeocin)筛选获得了稳定转化细胞系IE-hGM-CSF。转基因细胞基因组经PCR鉴定,成功检测到ie-hGM-CSF,western blot分析结果显示转化细胞表达的重组hGM-CSF的为22 kDa,ELISA检测结果显示hGM-CSF在转化细胞系里的表达水平大约为2 814.7 pg/106个细胞。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-12
第一部分：文献综述  12-36
  第一章家蚕生物工厂的研究现状  12-30
    第一节基于杆状病毒的反应器  12-17
      1 引言  12
      2 杆状病毒表达系统  12-14
      3 BEVS 的应用前景  14-15
      参考文献  15-17
    第二节基于转基因的家蚕生物工厂  17-30
      1 引言  17
      2 基于转座子介导的转基因载体  17-20
      3 基于基因打靶的转基因  20-23
      4 外源基因导入方法  23-25
      5 外源基因在家蚕中的表达  25-26
      6 总结与展望  26
      参考文献  26-30
  第二章人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子研究概况  30-36
    1 引言  30
    2 hGM-CSF 概述  30-33
    3 总结与展望  33
    参考文献  33-36
第二部分实验研究及报告  36-85
  第三章研究目的与内容  36-41
    1 研究目的及意义  36-37
    2 研究内容  37-38
    3 主要研究路线  38-41
  第四章实验材料与实验方法  41-58
    1 实验材料  41-47
    2 常用仪器  47-48
    3 实验方法  48-56
    参考文献  56-58
  第五章基于轻链基因打靶的转基因家蚕丝腺生物工厂表达hGM-CSF  58-68
    摘要  58
    1 引言  58-59
    2 材料与方法  59-61
    3 结果与分析  61-64
    4 讨论  64-65
    参考文献  65-68
  第六章分子设计赋予蚕丝具有绿色荧光特征  68-75
    摘要  68
    1. 引言  68-69
    2. 实验材料与方法  69-70
    3 实验结果与分析  70-72
    4 讨论  72-73
    参考文献  73-75
  第七章非转座子载体介导的稳定转化家蚕BmN 细胞表达hGM-CSF  75-85
    摘要  75
    1 引言  75-76
    2 材料与方法  76-78
    3 结果与分析  78-80
    4 讨论  80-82
    参考文献  82-85
结论  85-86
  1 已取得的成果  85
  2 有待进行的研究  85-86
附录一：英文简写符号说明  86-88
附录二：攻硕期间科研情况  88
资助项目  88-89
致谢  89-90

转基因家蚕/细胞表达hGM-CSF和绿色荧光蚕丝的制备

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