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转基因作物核酸快速提取和检测方法研究

作　者: 陈丽丽
导　师: 开国银；张大兵
学　校: 上海师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 转基因生物转基因玉米品系特异性可视化检测 LAMP检测快速检测快速提取 DNA提取
分类号: S188
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着越来越多的转基因作物的发展和商业化种植,转基因作物核酸快速提取及其检测技术的研究已经变得越来越必要。LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)是一种环介导的等温扩增方法,比较传统的聚合酶链式反应,它具有特异性高、简单、快速等特点,不需要精密昂贵的仪器(如:PCR仪)和繁琐凝胶电泳检测。由于实现了可视化的检测,在60分钟内就能完成检测,大大缩短了检测时间,适合转基因植物的现场快速检测。另外,现有的提取转基因作物的DNA方法所耗用的时间在90分钟左右,同时需要笨重的离心机作为提取时必需的仪器,我们研究了一种快速提取DNA的技术,可以将抽提DNA的时间由现有的90分钟左右缩短到10-15分钟左右。将快速提取DNA技术与快速检测LAMP方法相结合,就能在90分钟完成提取和检测转基因作物的整个过程,实现快速现场检测1、根据七种转基因玉米品系(DAS-59122-7, T25, BT176, TC1507, MON810, BT11 and MON863)的旁邻序列,设计品系特异性引物,优化LAMP反应体系,代替凝胶电泳方法,通过加入高浓度的SYBR Green I荧光染料的可视化方法来检测LAMP的产物。建立七种转基因玉米品系特异性检测的LAMP方法,同时将这种方法应用于实际样品的检测。实验结果证明建立的七种转基因玉米LAMP检测方法具有高特异性,除了MON810品系以外灵敏度都可以达到4个拷贝数的基因组DNA。并且将已经建立的检测方法运用于GIPSA(美国谷物检验、批发及畜牧场管理局)样品的检测,检测结果与最后的GIPSA的最终报告中结果相一致;2、本文研究转基因生物快速现场提取DNA技术,设计一种简单快速提取DNA的装置。这种技术采用气压法代替离心的方法,用简单的注射器的气压提取DNA的方法,代替笨重的离心机,将抽提DNA的时间由现有的90分钟左右缩短到10-15分钟左右,应用这种方法提取水稻,玉米,棉花,大豆的DNA,实现野外快速现场提取转基因作物的DNA。同时结合LAMP方法实现快速现场检测的目的。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章转基因植物及其产品检测技术研究进展  11-23
  引言  11
  1.1 全球转基因作物种植情况  11
  1.2 全球转基因作物种植的经济影响  11-12
  1.3 全球转基因作物及其产品的安全问题和标识管理  12-13
  1.4 转基因作物DNA 提取方法研究发展  13-15
  1.5 转基因作物的检测方法发展和现状  15-22
    1.5.1 PCR 检测  16-18
      1.5.1.1 传统的定性PCR 方法  16-17
      1.5.1.2 定量PCR 方法  17
      1.5.1.3 复合PCR 方法  17-18
    1.5.2 基于核酸检测的等温扩增方法  18-22
      1.5.2.1 依赖核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)..  18-19
      1.5.2.2 滚环扩增(Rolling circle amplification, RCA)  19-20
      1.5.2.3 链替代扩增(Strand displacement amplification, SDA)  20-21
      1.5.2.4 环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)  21-22
  1.6 研究的目的和意义  22-23
第二章转基因玉米LAMP 可视化检测方法研究  23-35
  2.1 实验材料、试剂与仪器  24
    2.1.1 实验材料  24
    2.1.2 实验试剂  24
    2.1.3 实验仪器  24
  2.2 实验方法  24-28
    2.2.1 基因组DNA 提取和纯化  25-26
    2.2.2 七种转基因玉米品系引物设计  26-27
    2.2.3 七种转基因玉米品系LAMP 反应程序的建立  27-28
    2.2.4 七种转基因玉米品系LAMP 产物的检测  28
  2.3 实验结果与讨论  28-33
    2.3.1 转基因玉米LAMP 扩增反应引物设计及方法建立  28-30
    2.3.2 玉米LAMP 方法特异性检测  30-31
    2.3.3 玉米LAMP 方法灵敏度检测  31-32
    2.3.4 可视化的LAMP 方法实际应用性评估  32-33
  2.4 本章小结  33-35
第三章转基因作物核酸快速提取研究  35-46
  3.1 实验材料、试剂与仪器  35-36
    3.1.1 实验材料  35
    3.1.2 实验试剂  35
    3.1.3 实验仪器  35-36
  3.2 实验方法  36-38
    3.2.1 植物核酸快速提取及提取效果评价  36
    3.2.2 传统的定性PCR 检测方法  36-37
    3.2.3 LAMP 检测方法  37-38
  3.3 实验结果  38-44
    3.3.1 快速提取装置设计原理  38-39
    3.3.2 快速提取方法的优化  39-41
    3.3.3 DNA 快速提取方法在转基因作物核酸DNA 提取中的应用  41-44
  3.4 本章小结  44-46
参考文献  46-52
附录  52-56
致谢  56-57
攻读硕士学位期间已发表或待发表的论文  57

转基因作物核酸快速提取和检测方法研究

内容摘要

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