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蚊杀虫剂抗性及其进化的初步研究

作　者: 史琳娜
导　师: 朱昌亮
学　校: 南京医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 蚊杀虫剂溴氰菊酯靶标抗性代谢抗性遗传进化
分类号: R384.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蚊可传播多种疾病,如疟疾、登革热等,严重危害人类健康。蚊媒控制一直是蚊媒病防治的重要手段。杀虫剂化学防制因其高效、速效、成本低廉、使用简便,成为蚊媒病防治的主要措施。然而长期大量地使用杀虫剂,导致蚊媒抗药性的发生和发展,蚊媒病防治效果不断下降,新发和重现的蚊媒病不断发生。抗药性已经成为蚊媒病防治工作中的最大障碍。蚊抗药性机制研究成为全球蚊媒防制研究的重点课题。本研究以我国分布广、种群密度高、实验室易于驯化饲养的重要家栖性病媒——淡色库蚊为研究对象,于山东唐口地区采集淡色库蚊自然种群,以当前使用最为广泛的溴氰菊酯逐代筛选建立抗性种群,动态监测不同杀虫剂选择压力下种群抗药性的发展规律,采用大样本的单蚊同时检测靶标抗性kdr和代谢抗性3大解毒酶系,揭示靶标抗性和代谢抗性在不同选择压力下抗药性变化规律,探索蚊抗药性的遗传进化机制。本研究的主要结果如下：1.不同选择压力种群的筛选以溴氰菊酯筛选淡色库蚊自然种群,实验筛选30代,历时28个月,成功建立3个不同选择压力作用下的种群：筛选组,以LC50浓度筛选,每代死亡率约50-60%；维持组,以第6代LC50浓度维持筛选,死亡率逐代降低,由50%降低到小于5%；停药组,于第6代后停止杀虫剂筛选。研究结果为抗药性遗传进化和生物系统进化及适应研究提供了良好的模型和材料。2.动态监测不同选择压力下种群抗药性的发展规律筛选组抗性水平逐代升高,至第30代种群LC5o上升到0.9713mg/L,抗性水平显著增高(p<0.001),抗性系数为47.15。维持组抗性水平亦逐代升高,趋势较筛选组缓慢,至第30代种群LC50上升到0.4367mg/L,抗性水平显著增高(p<0.001),抗性系数为21.20。停药组抗性水平逐代降低,从第6代到第30代,抗性水平LC50由0.0501mg/L降低到0.0241mg/L,抗性系数由2.43降低到1.17,抗性水平显著降低(p<0.001),但仍高于第一代(LC50=0.0206mg/L)。以上结果表明,种群在长期接触拟除虫菊酯类杀虫剂后,抗药性显著增高,抗性发展的速度与杀虫剂选择压密切相关,杀虫剂的选择压力越高,抗性程度发展越快。种群对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性不稳定,停用杀虫剂可使抗性下降,但抗性衰退趋势十分缓慢,停用时间必须维持一个相对长的时间。此外,种群长期接触低剂量杀虫剂亦会导致抗药性的产生。如维持组以恒定低剂量的溴氰菊酯筛选,其抗性水平亦随时间而增加,虽然趋势较筛选组缓慢,但至第30代抗性水平上升了21.20倍。3.单蚊同时检测不同选择压力下种群靶标抗性和代谢抗性的变化规律实验共检测3000份单蚊样本,由于序列测定及酶活性检测过程中部分样本未有结果,最终我们成功测序样本为2427份,成功检测P450s、ESTs和GSTs样本分别为1541、1368和1665份。筛选组中,靶标抗性kdr基因频率变化为：等位基因L1014F的频率逐代增高,至第14代频率增加到100%,14代后种群成为kdr抗性基因纯合群体；等位基因L1014和L1014S的频率逐代降低。代谢抗性酶活性变化为：种群单加氧酶活性随种群抗性水平的升高而逐代增高,至第30代约增加2.20倍,14代后种群单加氧酶活性呈现显著增加趋势；种群羧酸酯酶活性随种群抗性水平的升高而逐代增高,至第30代约增加1.55倍,活性增加趋势较平稳,第14代后酶活性增加趋势显著；谷胱甘肽S－转移酶活性与种群抗性水平无相关性。维持组中,靶标抗性kdr基因频率变化为：等位基因L1014F的频率逐代增高,至第26代频率增加到100%,26代后种群成为kdr抗性基因纯合群体；等位基因L1014和L1014S的频率逐代降低。代谢抗性酶活性变化为：种群单加氧酶活性亦随种群抗性水平的升高而逐代增高,但增加趋势较筛选组缓慢,至第30代约增加1.62倍,26代后种群单加氧酶活性呈现显著增加趋势：种群羧酸酯酶活性亦随种群抗性水平的升高而逐代增高,但增加趋势较筛选组缓慢,至第30代约增加1.15倍,增加趋势缓慢平稳；谷胱甘肽S-转移酶活性与种群抗性水平无相关性。停药组中,靶标抗性kdr基因频率变化为：等位基因L1014F的频率逐代降低,第6代为91.79%,至第30代频率减少到82.27%,但仍显著高于第1代(72.64%)；等位基因L1014S的频率逐代升高。代谢抗性酶活性变化为：种群单加氧酶活性随种群抗性水平的降低而逐代减少,至第30代约减少0.81倍；种群羧酸酯酶活性随种群抗性水平的降低而逐代减少,至第30代约减少0.59倍；谷胱甘肽S-转移酶活性与种群抗性水平无相关性。以上不同选择压力下,靶标抗性kdr基因频率、代谢抗性酶活性变化与抗性水平关系分析表明：等位基因L1014F与抗性表型呈正相关,其频率随抗性水平的升高而增加,且增加的速率与选择压力相关。单加氧酶与羧酸酯酶活性的增加,是代谢抗性产生的主要原因,其中以单加氧酶活性增加为主要因素。表明kdr、单加氧酶与非专一性酯酶可望一同作为现场抗药性检测的分子靶标。代谢抗性和靶标抗性共同参与种群抗药性,在抗药性早期,靶标抗性发挥主导作用；当抗药性进化到一定阶段后,代谢抗性开始发挥主导地位,抗性水平出现显著上升。杀虫剂选择压力对两种抗性机制选择力度不同,是导致两种机制先后发挥作用的主要因素。去除杀虫剂选择压力后,代谢抗性相对靶标抗性衰退显著,提示代谢抗性适应度代价相对靶标抗性较高,在杀虫剂选择压力下,具有靶标抗性的个体被优先选择下来。对于抗药性是否还与钠离子通道基因其他位点突变有关,解毒酶家族成员在抗性中的作用及其机制仍有待进一步研究。本研究以蚊自然种群为研究对象,对不同选择压力下种群抗药性发展进行了30代动态检测,采用大样本的单蚊同时检测种群靶标抗性kdr和代谢抗性3大解毒酶系在不同选择压力下的变化,初步探讨蚊抗药性的遗传进化规律,研究结果可望为杀虫剂的合理使用、抗药性机制研究、抗药性的检测和治理提供科学依据。

全文目录

中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-14
前言  14-19
材料与方法  19-27
  一、实验材料  19-20
    (一) 供试蚊  19
    (二) 主要试剂  19
    (三) 主要溶液  19-20
    (四) 主要仪器  20
  二、实验方法  20-27
    (一) 蚊抗性种群的筛选与建立  20-22
    (二) 蚊种群钠离子通道基因多态性与进化研究  22-24
    (三) 蚊种群代谢抗性与进化的研究  24-27
结果  27-51
  一、蚊抗性种群的筛选与建立  27-30
    (一) 筛选组抗药性变化规律  27
    (二) 维持组抗药性变化规律  27-28
    (三) 停药组抗药性变化规律  28-29
    (四) 杀虫剂选择压力与种群抗性水平相关性分析  29-30
  二、蚊种群钠离子通道基因多态性与进化研究  30-39
    (一) 种群kdr基因多态性分析  30-34
    (二) 筛选组kdr基因频率变化规律  34
    (三) 维持组kdr基因频率变化规律  34-35
    (四) 停药组kdr基因频率变化规律  35-36
    (五) 靶标抗性与种群抗性水平相关性分析  36-37
    (六) kdr基因遗传进化分析  37-39
  三、蚊种群代谢抗性与进化的研究  39-51
    (一) 种群单加氧酶活性的变化规律  39-41
    (二) 种群谷胱甘肽S-转移酶活性的变化规律  41-43
    (三) 种群羧酸酯酶活性的变化规律  43-45
    (四) 靶标抗性、代谢抗性与种群抗性水平相关性分析  45-51
讨论  51-60
小结  60-61
参考文献  61-70
综述  70-93
  参考文献  81-93
攻读学位论文期间文章发表情况  93-94
致谢  94

蚊杀虫剂抗性及其进化的初步研究

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