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大豆疫霉G蛋白α亚基互作蛋白的筛选及功能分析

作　者: 郝玉娟
导　师: 王源超
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆疫霉 G蛋白α亚基 酵母双杂交 GST Pull-down 基因沉默
分类号: S432.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


大豆疫霉(Phytophthora sojae)作为十分重要的植物病原卵菌之一,在大豆生产中引起毁灭性的病害——大豆疫霉根腐病。大豆疫霉无性生活史阶段产生孢子囊,释放游动孢子。在田间传播过程中,游动孢子识别寄主分泌的化学信号,定向游动定殖完成对寄主植物的侵染。因此,了解大豆疫霉游动孢子趋化性的分子调控机制,可以为有效的病害防控策略提供新的思路及方向。大豆疫霉G蛋白α亚基互作蛋白的筛选。实验室前期研究发现,大豆疫霉G蛋白Q亚基能够调控游动孢子对大豆根部释放的异黄酮的趋化性,揭示了G蛋白信号途径在大豆疫霉孢子囊形成和游动孢子行为方面具有一定的作用。为了了解大豆疫霉G蛋白α亚基通过调控哪些基因从而在G蛋白信号途径中起作用,我们利用酵母双杂交技术在大豆疫霉cDNA文库中筛选Gα亚基的互作蛋白。通过多次实验并对结果的初步验证,我们筛选得到了一个能够与Gα互作的激活态蛋白激酶C受体(Receptor of Activated Protein Kinase C)通过序列比对分析,该蛋白的同源基因为拟南芥中的AtRACK1,因此我们将该基因命名为PsRACK1.PsRACKl与Gα亚基一对一互作验证。在G蛋白信号途径中,Gα亚基存在激活与非激活两种不同形态。报道证明将非激活态Gα亚基R117位和Q203位的保守氨基酸精氨酸和谷氨酰胺替换为组氨酸和亮氨酸,可以破坏Gα亚基的GTP酶活性将其锁定在与GTP结合的激活状态。为了验证PsRACK1是否与两种形态的Gα蛋白均能够互作,我们分别用酵母双杂交和GST Pull-down体外互作验证技术对PsRACK1与PsGPAl和PsGPA1(R177H,Q203L)进行互作验证。两种实验技术所得结果均表明：PsRACK1能够与非激活态的PsGPA1直接互作,而与激活态的PsGPA1(R177H,Q203L)不能直接互作。大豆疫霉PsRACK1功能研究。为了了解PsRACK1在大豆疫霉中的功能,本文采用PEG介导的原生质体转化方法对PsRACK1进行沉默,得到两个沉默转化子。对PsRACK1沉默突变体营养生长、有性生殖、对胁迫因子的耐受性和致病力变化等方面表型进行一系列测定后发现,沉默突变体卵孢子产量较野生型显著下降,推测PsRACK1调控大豆疫霉有性生殖。

全文目录


目录  4-6
摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
上篇 文献综述  9-22
  1 G蛋白信号途径  10-11
  2 G蛋白信号途径的研究进展  11-19
    2.1 人类和动物中的G蛋白信号途径  11-12
    2.2 植物中的G蛋白信号途径  12-15
    2.3 真菌中的G蛋白信号途径  15-17
    2.4 卵菌的G蛋白信号途径  17-19
  参考文献  19-22
下篇 研究内容  22-54
  1. 材料与方法  26-40
    1.1 试剂及培养基  26-28
    1.2 供试菌株及大豆品种  28-29
    1.3 Gateway技术构建酵母表达载体  29
    1.4 诱饵蛋白自激活活性检测  29
    1.5 大豆疫霉cDNA文库构建  29-30
    1.6 酵母双杂交(醋酸锂法)  30
    1.7 利用酵母双杂交筛库流程  30-31
    1.8 酵母转化子PCR验证  31
    1.9 酵母质粒提取  31-32
    1.10 酵母双杂交载体构建  32
    1.11 Bait、Prey蛋白毒性与自激活活性验证  32
    1.12 Western blot验证目的蛋白表达  32-33
    1.13 酵母双杂交一对一互作验证  33
    1.14 HIS3和ADE2报告基因的表达检测  33
    1.15 LacZ、MEL1基因检测  33-34
    1.16 GST Pull-down验证蛋白体外互作  34-36
    1.17 大豆疫霉基因沉默转化载体构建  36
    1.18 大豆疫霉遗传转化  36-39
    1.19 基因沉默转化子筛选  39
    1.20 致病性测验  39
    1.21 沉默突变体表型分析  39-40
  2. 结果与分析  40-50
    2.1 酵母双杂交筛库部分结果  40-41
    2.2 酵母双杂交验证PsRACK1与PsGPA1一对一互作结果  41-43
    2.3 GST Pull-down验证PsRACK1与PsGPA1一对一互作结果  43-44
    2.4 大豆疫霉PsRACK1功能分析结果  44-50
  3. 讨论  50-52
    3.1 酵母双杂交研究手段  51
    3.2 PsRACK1与激活和非激活态Gα亚基的互作验证  51
    3.3 PsRACK1参与调控大豆疫霉卵孢子的产生  51-52
  参考文献  52-54
附录  54-64
攻读硕士学位期间发表的研究论文  64-66
致谢  66

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 植物病理学
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